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1、转基因大豆的检测实验设计生物技术安全评估092012年5月目录3.实验一k大豆样品的准备4实验二大豆DNA的提取和纯化4实验三靶标基因的扩增6实验四反应产品检测10实验五结果分析12参考文献12丽吞随着转基因工程技术的迅速发展与在生物改良及遗传育种中的大规模应用，转基因生物(GeneticallyModifiedOrganism)及其产品的种类越来越多，含有的外源基因类型也越来越多。抗草甘麟(glyphosate)大豆(商品名，roundupreadysoybean)是在传统大豆株VarietyA5403中转入外源基因CAMV-35S启动子、抗草甘
2、麟基因CP4-EPSPS和NOS终止子而得到。它是目前使用最广的转基因作物之一,每年至少有800万吨转基因大豆进入我国市场。因此，研究抗草甘麟大豆的快速检测方法具有重要意义。基于核酸的检测技术主要有PCR方法和基于PCR原理的其他检测方法如多重PCR、巢式PCR等等。普通PCR方法已经成为转基因检测中常用的方法，通常是作为定性检测方法，早在2003年就成为出入境检验检疫系统的行业标准。这些标准涉及的转基因作物有大豆(SN/T1195-2003)、玉米(SN/T1196-2003)>棉花(SN/T1199-2003)>油菜籽(SN/T1197-200
3、3)>烟草(SN/T1200-2003)和马铃薯(SN/T1198-2003)o目前广泛应用于进出口商品的转基因成分检测。随后在2004年又制定了转基因定性检测的国标(GB/T19495.4-2004),该国标中用的方法还是普通PCRO因此，普通PCR方法的研究主要在于新的转基因作物的鉴定研究。本实验以三种大豆为材料进行比较，通过对其DNA的提取和纯化,靶标基因的获取及琼脂糖电泳分析，从而鉴定所检测大豆样品。采用PCR检测转基因大豆的方法，主要是采用琼脂糖凝胶电泳法，首先检测CAMV-35S启动了进行筛选，然后检测EPSPS抗草甘麟基因。实验一大豆
4、样品的准备一样品来源：（原始样品最小质量为：11200克）1、阳性抗草廿麟转基因大豆标准物质（IRMM-410R,Fluka公司）2、进口转基因大豆样品3、非转基因大豆由国家进出口商品检验研究所提供。二样品加工过程：1、构成原始样品（原始样品不得低于试验样品的4倍）2、样品的初步处理（去皮、去壳、除水、除油等应记录初步处理前后样品的质量变化）3、破碎和研磨4、缩分5、实验室样品的制备（实验室样品的最小质量不能小丁原始样品最小质量的1/16）6、存查样品和式样的制备实验二大豆DNA的提取和纯化（CTAB法）一实验目的掌握用CTAB法提取真核细胞总DN
5、A的原理、步骤和注意事项。二实验原理1CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基澳化钱），是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中（＞0.7mol/LNaCl）,CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15°C时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15°Co2、CTAB提取缓冲液各成分的作用：（
6、1）Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏（2）EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性（3）NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解,存在于液相中（4）C3-疏基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醍，避免褐变，使酚容易去除基因组DMA（5）主要作用物质就是氯仿，所以它占有的比例较大，而异戊醇的主要就是防止起泡泡。三实验仪器和实验试剂1.仪器：水浴锅离心机EP管电泳仪研钵2.试剂：去离子水乙醇氯仿-异戊醇液氮CTAB缓冲液：CTAB20g/L,Tris-HCI0.1mol/L(pH8.0),EDTA0.02m
7、ol/L.TE缓冲液：lonunol/LTris.,1mmol/I,EDTA,pH8.0).酶溶液:5Mg/m.材料：阳性抗草甘麟转基因大豆标准物质(IRMM-410R,Fluka公司)、进口转基因大豆样品和非转基因大豆由国家进出口商品检验研究所提供。四实验步骤(三种材料分别进行)1.洗干净大豆叶片，用75%的酒精表面消毒3min,用去离子水冲洗：P4次2.称取lg叶片放入灭过菌的研体中，加入液氮捣碎，迅速转入2nd离心管中。3.加入600MCTAB缓冲液，震荡均匀，65°C温育30min.4.加入500ul酚：三氯甲烷：异戊醇(25:24:1),
8、振荡均匀,12000r/min,离心15min05.吸取上清液，放入另一新管中，加入等体积的异丙醇，12000r7min,
