13秋基因工程复习提纲1

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1、第一章绪论基因工程概况1、第一个实现DNA重组的人，现代基因工程的创始人——1972年，美国斯坦福大学医学屮心的P.Berg2、基因工程诞生的元年——1973年，以科恩（Coher）和博耶（Boyer）建立的基因工程的基本模式为标志3、基因工程概念：按照人们事先设计的蓝图，在体外将不同来源的DNA分子进行剪切重组，与载体DNA形成镶嵌DNA分子（即重组DNA分子），然后将之导入宿主细胞，使之在宿主细胞屮扩增表达，从而使宿主或宿主细胞获得新的遗传特性，或形成新的基因产物。理论依据：不同基因具科相同的物质基础、基因是可以切割的、

2、基因是可以转移的、多肽与葙因之间存在对应关系、遗传密码是通用的、葙因可以通过制把遗传信息传递给下一代。基本技术路线主要内容（基因工程的上游操作过程可简化为：切、接、转、增、检）及基本要素。①从供体细胞屮分离出基因纟IIDNA,川限制性核酸内切酶分别将外源DNA（包拈外源基因或目的基因）和载体分子切开（切）；②川DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，形成DNA重组分子（接）;③借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中（转）：④短时间培养转化细胞，以扩増DNA重组分了•或使其整合到受体细胞的难因组中（增）

3、；⑤筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞（检）。要素：基因工異酶载体受体细胞7、基因工程的现实应用方Ifti噬歯体遗传学细歯抗药性的遗传学插人生殖细胞定点突变改功能分析序列分析变基因结构基因工程的诞生与有关学科之间的联系第二章基因克隆所需的工具酶1、基因工程使用的工其酶的种类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶，其巾以限制性内切酶和DNA连接酶为主的多种工具酶的发现和应用，为葙因操作提供广丨•分重要的技术菽础。2、限制性核酸内切酶的类型（I、II、III类）命名（一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前

4、两个字母组成，第叫个字母表示菌株（品系），即属名+种名+株名。）基木特性（回文序列，palindromes,一段自我互补的DNA顺序，柯对称轴，即上下链从5’一＞3"^向所读的顺序完全一样）。通常双链DNA被酶切后可岀现三种形式的末端：5’突ili的粘末端；3’突出的粘末端；T•末端。切割频率：识别序列的频率=（1/4）n（n代表识别序列的碱基数0）3、同裂酶（isoschizomers）：有一些來源不同的限制酶识别的足同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。同尾酶（isocaudamer）：这一类的限制酶来源各异，识别的靴

5、字序列也不相同，产生相同的粘性末端。稀切酶：有较K:的识別序列和富含GC或AT的识别序列的限制性核酸内切酶，在基因操作屮使用稀切酶可获得人的片段。4、星性（Star）活性产生的原因某些限制性核酸内切酶在特定条件卜，可以在不是原来的识別序列处切割DNA,这种现象称为Star活性。在“非最适的”反应条件卜7包牯高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg24•以及高pH值等等）,有些核酸内切限制酶识别序列的特好性便会发生“松动”，从其“II:确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子。5、DNA连接酶的连接

6、机理：DNA连接酶是一种封WDNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5*-PO4与另一DNA链的3*-OH生成磷酸二酯键。但这W条链必须是与M—条互补链配对结合的（T4DNA连接酶除外），而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。常用的DNA连接酶：人肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接酶、TscDNA连接酶。DNA片段的连接方法：互补黏性末端片段之叫的连接、平末端片段之叫的连接、片段末端修饰P进行连接。6、DNA修饰酶的种类和功能（1）末端脱賦核苷酸转移酶，功能是：简称未端转移酶，

7、能够催化5'脱氧核苷三磷酸进行5'—3'方向的聚合作用；不需耍模板存在就可以催化DNA分子发生聚合作用。（2）碱性磷酸醋酶，菌碱性磷酸酶（bacterialalkalinephosphatase,筋称BAP）;小个•肠碱性磷酸酶（calfintestinalalkalinephosphatase,筒称CIP），功能是：使DNA（或RNA）片段的5'-P末端转换成5'-OH末端。（3）T4多聚核苷酸激酶，从T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞中分离岀来，功能是：催化Y-磷酸从ATP分子转移给DNA或RNA分子的5'-OH末端。（4）甲

8、基化酶，功能是：可使细菌DNA分子屮的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤；5’-甲基胞啼啶（Dcm甲基化酶识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个胞嘧啶C的C5位置上引入甲基）；6’-甲基腺嘌呤（Dam甲基化酶可在GATC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基）。常