实训三细菌的简单染色和革兰氏染色

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1、实训三细菌的简单染色和革兰氏染色微生物与发酵工艺微生物中的细菌，其细胞小而透明，用压滴片或悬滴片在光学显微镜下观察时，菌体和背景没有明显的明暗差，不易看清其形态，更难以识别它们的结构。因此，需要对菌体进行染色，借助于染料使菌体着色后颜色的反衬作用，观察细菌的形状、基本结构(壁、膜、细胞质、核及内含物)及附属结构(荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢等)。1.学习微生物的涂片染色的操作技术。2.掌握微生物的简单染色、革兰氏染色的基本原理和方法。一、实验目的微生物（尤其是细菌）的机体是无色透明的。在显微镜下，微生物体与其背景反差小，不易看清

2、微生物的形态和结构。若增加反差。则微生物的形态皆可以看清楚。通常用染料将菌体染上颜色以增加反差，便于观察。二、实验原理微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成，所以微生物细胞表现出两性电解质的性质。经测定，细菌的等电点在pH2—5之间，故细菌在中性、碱性或偏酸性的环境中，都体现酸性，带负电荷，容易与带负电荷的碱性染料结合，从而使菌体染色。菌体染色分为简单染色和复染.二、实验原理简单染色又称单染，只用一种染料使菌体着色。若仅为在显微镜下看清细菌形态，用单染即可。复染是指用两种或多种染料染细菌，目的是鉴别不同性

3、质的细菌，主要方法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。二、实验原理革兰氏染色步骤是：先用草酸铵结晶紫染色，经媒染剂碘-碘化钾溶液处理后用乙醇脱色，最后用沙黄染液（也称蕃红染液）复染。如细菌能保持草酸铵结晶紫与碘的复合物而不被脱色，用蕃红液复染后仍呈紫色，则该细菌称为革兰氏阳性菌（G+）；被乙醇脱色用蕃红复染后呈现红色，则称为革兰氏阴性菌（G-）。现在已知，革兰氏染色结果与细菌细胞壁的结构组成有关。二、实验原理1.菌种大肠杆菌(Escherichiacoli)金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)枯草芽孢杆菌(

4、Bacillussubtilis)普通变形杆菌(Proteusvulgaris)三、实验材料和用具2.染液①简单染液：齐氏石炭酸复红染液②革兰氏染液草酸铵结晶紫染液(染液)卢戈氏碘液(媒染剂)95％乙醇或丙酮(脱色剂)沙黄乙醇溶液(复染剂)吕氏美蓝染液。三、实验材料和用具3.用具显微镜、酒精灯、接种环、无菌水、香柏油、二甲苯、牙签、载玻片、纱布、滤纸、镜头纸、镊子、染色缸、火柴、玻片架、烧杯等。三、实验材料和用具1.制片①涂片取保存在酒精溶液中的干净玻片，在酒精灯上烧去残留酒精，待凉，用记号笔在玻片的右侧，注明菌名、

5、染色类型。在玻片中央滴加一小滴无菌水，以无菌操作取少许菌苔，在玻片的水滴中涂布均匀，成一薄层。四、实验方法②风干在空气中自然干燥。切勿在火焰上烘烤。③固定将已干燥的涂片向上，在微火上迅速通过2～3次，使得菌体与玻片结合牢固。四、实验方法①简单染色：在已制好的涂片菌膜处，滴加吕氏美蓝染液染色3～5min，或滴加齐氏石炭酸复红染液染色1～2min。以流水冲洗涂片。至水无色为止，后用滤纸吸干涂片的水滴，干后，待镜检。②革兰氏染色a.在已制好的涂片菌膜处滴加草酸铵结晶紫染液，染色lmin，水洗。2.染色四、实验方法b．滴加路哥氏碘

6、液媒染lmin、水洗。用滤纸吸干残存水滴。c．斜置玻片于烧杯上端，滴加95％乙醇脱色并轻轻摇动载玻片。直洗至流出乙醇刚刚不出现紫色时即停止(约0.5～lmin)，脱色完毕后，水洗，滤纸吸干。d．滴加沙黄染液复染lmin。水洗，滤纸吸干后，备镜检。四、实验方法五、实验内容1.用金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌制简单染色片，在油镜下观察。2.用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、普通变形杆菌、枯草芽孢杆菌制革兰氏染色片，油镜下观察，区别革兰氏阳性菌和阴性菌。1.试述革兰氏染色的程序及染色原理。2.将本实验观察结果记录于表中。六、实验报告染色

7、方法菌名染色结果简单染色吕氏美蓝染色齐氏蕃红染色革兰氏染色1.为什么细菌染色时所用的染料多属于碱性染料?为什么涂片需要固定?为什么制片干燥后才能用油镜观察?2.革兰氏染色过程中，哪些因素是成败关键，为什么?七、思考题