培养物的污染与防止

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1、培养物的污染与防止第四章培养物的污染凡是混入培养环境中对细胞生存产生有害的成分和造成细胞不纯的异物都应该视为污染。组织培养污染物应包括：生物（真菌、细菌、病毒和支原体）化学物质（影响细胞生存的化学成分）细胞（非同种的其他细胞）其中一微生物最为多见。不同细胞交叉污染，造成细胞不纯。教学内容污染途径污染对培养细胞的影响及污染的检测细菌污染真菌污染支原体污染细胞交叉污染污染的预防一、污染途径污染物，特别是微生物常通过下列途径进入培养体系，造成污染。空气器材操作血清组织样本一、污染途径1、空气空气是微生物及尘埃颗粒传播的主要途径。空气流动性大，如果培养操作场地于外界隔离不严格或消毒不充

2、分，外界不洁空气很容易进入造成污染。因此，培养设施不能设在通风场所。无菌操作应在净化台内进行，工作时要带口罩，以免因讲话、咳嗽等使外界污染进入操作面，造成污染。一、污染途径2、器材各种培养器皿、器械消毒不彻底和洗刷不干净导致污染，另外需要对培养箱进行定期消毒，防止形成污染一、污染途径3、操作实验操作无菌观念不强，技术不熟练，使用污染的器皿或封瓶不严等，都可以造成污染。培养两种细胞以上时，操作不规范，交叉使用吸管或培养液、瓶等有可能导致细胞交叉污染。一、污染途径4、血清有些血清在生产时就已经被支原体或病毒等污染，变成了污染。一、污染途径5、组织样本原代培养的污染多数来源于组织样本

3、；取材时碘酒消毒后脱碘不彻底，可造成碘混入组织，细胞或培养液中，影响细胞细胞生长。二、污染对培养细胞的影响及污染的检测细胞污染早期或污染程度较轻时，如果能及时去除污染物，部分细胞有可能恢复但是当污染物持续存在培养环境中，轻者细胞生长缓慢，分类象减少，细胞变得粗糙，轮廓增强细胞浆出现颗粒、污染较严重，细胞增值停止，分裂象消失，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆、脱壁。因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。（一）细菌污染对培养细胞的影响及污染物的检测常见的细菌有大肠杆菌、假单孢菌、葡萄球菌等。细菌污染初期由于培养体系的抗生素作用，其繁殖处于抑制状态，细胞生长不受明显影响，污染情况

4、用倒置显微镜观察不易判断。怀疑培养细胞有细菌污染时，取10ml细胞悬液离心1000转5分钟，沉淀中加入无抗生素培养液2ml,将细胞放培养箱培养。当污染的细菌量比较大，导致培养液外观浑浊，肉眼就可以判断。细菌污染大多数可以改变培养液pH，使培养液变浑浊、变色。用相差显微镜观察，可见满视野都是点状的细菌颗粒，原来的清晰培养背景变得模糊，大量的细菌甚至可以覆盖细胞，对细胞的生存构成威胁。用青霉素、链霉素可以预防细菌污染有效。（一）细菌污染对培养细胞的影响及污染物的检测（二）真菌污染对细胞的影响及污染物的检测微生物污染中以真菌最多，真菌种类繁多，形态各异，但是污染后易于发现，大多呈白色

5、或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下可见呈丝状、管状、树枝状，纵横交错穿行于细胞之间。念珠菌和酵母菌卵圆形，散在细胞周边和细胞之间生长。真菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长、产生有毒物质杀死细胞。抗真菌制剂对预防和排除真菌污染有效。（三）支原体污染对细胞影响及污染物的检测细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题,是细胞培养最常见的、干扰试验结果的一种污染。但由于不易被察觉，有些污染的细胞仍在被应用。研究表明，95％以上是以下四种：口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体和莱氏无胆甾原体，为牛源性。以上是最常见的污染细胞培养的支原体菌群，但能够污染

6、细胞的支原体种类是很多的，国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。据查，目前各实验室使用的二倍体细胞和传代细胞中约有11%的细胞受到支原体污染。污染来源包括工作环境污染、操作者本身污染（一些支原体在人体是正常菌群）、培养基污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。（三）支原体污染对细胞影响及

7、污染物的检测细胞培养中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基中加入适量的抗生素。（三）支原体污染对细胞影响及污染物的检测没有被支原体污染的细胞被支原体污染的细胞支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如-内酰胺类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌素、利福平、磺胺