烫伤大鼠中枢氨基酸递质和心血管功能改变的关系论文

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1、烫伤大鼠中枢氨基酸递质和心血管功能改变的关系论文.freela公司产品；3H-GABA由上海原子核研究所提供，比活性：35.12Bq/mg；海人酸(KA)由南京大学生化系提供。1.2动物分组及烧伤模型制备SD大鼠(分别由南京大学实验动物中心和长海医院实验动物中心提供)，雄性，体质量200～250g，烫伤后随机分为3组：下丘脑氨基酸递质测定组、下丘脑GABA受体测定组和侧脑室给药组，3组均设相应平行对照组。药物为GABA受体拮抗剂PT和谷氨酸受体激动剂KA，注入量均为10μl，浓度均为0.1mmol/L。大鼠俯卧于鼠板上，背部剃毛，100℃水烫20s，形成3

2、0%TBSAⅢ度烫伤模型。1.3下丘脑氨基酸递质测定参照南京大学生化系脑组织氨基酸相对含量测定方法。步骤如下：大鼠断头后立即投入液氮中冷冻，30min后取下丘脑，称量后放入装有预冷的75%乙醇匀浆器中2000r/min匀浆30s，倒入蛇型回流冷凝器，90℃水浴加热10min，置离心管内4000r/min离心20min，上清液在90℃水浴中加热蒸发乙醇，冷却后倒入球型分液漏斗，加无水乙醚10ml，振荡后静置10min，下层水相液体放入三角烧杯，40℃水浴蒸发乙醚，并用干燥箱在60℃抽干备用。测定时将标本用1.0mol/LHCl和0.1mol/LNaOH定容，

3、充分搅伴后取10μl，置氨基酸自动化分析仪中分析氨基酸色谱。分析柱：4mm×150mm，树脂：2619型；脱氨柱：4mm×50mm，树脂：2950型；柱温：53℃，洗脱液泵1∶0.225ml/min，茚三酮泵2∶0.3ml/min。分析程序为12min标准蛋白质水解液程序。根据氨基酸峰面积计算氨基酸相对含量。1.4下丘脑GABA受体测定采用神经元突触膜放射配基结合测定法检测下丘脑GABA受体的最大结合容量(Bmax)和平衡解离常数(Kd)值。1.4.1突触膜制备剪头，取下丘脑置于冷生理盐水中，按脑∶蔗糖为1∶4比例加入0.32mol/L蔗糖(去蛋白)，标本

4、匀浆管置于冰水中电动匀浆(8档，上下7～8次，约2min)，匀浆液分装，以0.32mol/L蔗糖配平质量，放入低温离心机，以1500r/min离心10min，取上清液(内含膜)，分装配平，放入低温离心机，以1×104r/min离心20min，去上清液，留沉淀物(内含膜)，沉淀物中加入10mmol/LTris-HAc溶液1ml，放入低温离心机，以1×104r/min离心20min，去上清液，再留沉淀物，再加入10mmol/LTris-HAc溶液配平质量，1×104r/min离心20min，去上清液，留沉淀物加适量Tris-HAc溶液冷冻保存。1.4.2加样设

5、双复管，每管内加入不同浓度的放射配基(3H-GABA)和定量膜蛋白(约100μg)，平行的非特异管再加入抑制剂(非标记的GABA)，用Tris-HAc缓冲液补足至总反应体积为500μl，25℃孵育振荡60min，以预冷的Tris-HAc缓冲液(pH7.4)终止反应，立即用49型玻璃纤维滤纸抽滤，用预冷的Tris-HAc溶液洗涤、抽滤，取下滤膜置于闪烁瓶内，烘箱内烘干待测。1.4.3检测闪烁瓶中加5ml闪烁液，用美国BeckmanLS-9800型液体闪烁仪计数。蛋白质量浓度用考马斯亮蓝法测定，按Scatchard作图法，计算出最大结合容量Bmax和平衡解离常

6、数Kd值。1.5大鼠侧脑室给药方法根据Pellegrino图谱的定位方法，将大鼠固定在立体定向仪上，按侧脑室位置在颅骨上钻孔(以颅骨矢状缝、冠状缝交点为原点，孔中心位于原点向左旁开1.6mm处，前后不移动)，将侧脑室套管垂直埋入并固定，用10μl微量注射器将药物注入，实验结束后作脑切片证实套管位置是否正确。1.6记录心血管指标导管分别插入股动脉和经颈总动脉插入左心室，与压力-电压换能器相连，由四导生理仪放大后记录平均动脉压(MAP)、左心室收缩压(LVSP)、左心室内压最大变化速度(±dp/dtmax)。各项指标以烫前水平为100%，观察烫伤大鼠注射药物后

7、2h各指标的相对变化。1.7统计学处理实验数据以±s表示，采用t检验。2结果2.1烫伤大鼠侧脑室注入PT和KA对心血管指标的影响烫伤大鼠侧脑室注入PT可较显著地阻挡其心血管指标的下降趋势，注入KA对心血管指标也有一定的影响。2.2烫伤大鼠下丘脑氨基酸递质含量的改变与对照组相比，GABA含量在伤后1h已有升高，伤后2h则明显升高(P＜0.05)；谷氨酸含量在烫伤后1，2h有所降低；其他氨基酸递质含量无明显改变(表2)。2.3烫伤大鼠下丘脑GABA受体的改变与对照组相比，烫伤组高亲和力GABA受体和低亲和力GABA受体的Bmax均明显增加(P＜0.05)，但K

8、d值无明显改变。3讨论烧伤休克是一类影响因素较为复杂的循环休克，其