中、重症呼吸道合胞病毒感染小鼠模型的实验探究

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1、中、重症呼吸道合胞病毒感染小鼠模型的实验探究【摘要】目的建立呼吸道合胞病毒(RSV)感染的中、重症小鼠模型。方法36只小鼠分为实验Ⅰ组（16只）、实验Ⅱ组（16只）和正常对照组（4只）。采用RSV原液（TCID50为10-4.2/100μl）及100TCID50RSV液分别滴鼻感染实验Ⅰ、Ⅱ组BALB/c小鼠，于感染后第3、5、7、9d处死小鼠，进行病毒分离，病理光镜和电镜检查。结果①实验Ⅰ组的病毒分离阳性率明显高于实验Ⅱ组，二者相比有显著性差异（P0.01）；②光镜下实验Ⅰ组肺泡壁明显增厚，毛细血管扩张充血，有较多的淋巴细胞浸润，以Ⅲ级炎症为主；实验Ⅱ组病变较实验Ⅰ组

2、轻，Ⅲ级炎症面积及炎性细胞浸润支气管百分数少于实验Ⅰ组，两组间有显著差异（P0.05）。2组病变以第5d最重，第7d后开始减轻。③电镜下实验Ⅰ组可见肺泡Ⅰ型、Ⅱ型上皮细胞及毛细血管内皮细胞肿胀，肺泡隔水肿，淋巴细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞浸润；实验Ⅱ组病变轻于实验Ⅰ组。结论用RSV原液可以成功地建立中、重症RSV感染的动物模型。【关键词】呼吸道合胞病毒；模型呼吸道合胞病毒（RSV）是2岁以下婴幼儿毛细支气管炎和病毒性肺炎的主要病原之一，病情严重者可发生呼吸衰竭，甚至死亡。但是到目前为止，尚无用于RSV感染的特效药，而且其发病机制尚不清楚，因此亟须建立一个中、重症RSV感

3、染动物模型，以研究RSV感染导致的疾病。本实验采用不同浓度的RSV液感染小鼠，以期获得一个中、重症RSV感染模型。1材料和方法1.1材料RSVLong株及人喉癌上皮细胞系（Hep-2细胞），购自北京儿科研究所。清洁级近交系BALB/c雌性小鼠36只，6～8周龄，体重20±2g，由解放军第四军医大学实验动物中心提供。1.2方法1.2.1病毒毒力滴定将RSV-Long株滴入生长状态良好的单层Hep-2细胞（细胞浓度1×105）中，发生细胞病变后连传3代，在细胞融合病变最明显时，用力振荡细胞瓶，使细胞从瓶壁脱落，反复冻融3次，4℃离心，去除细胞散片，取上清液，采用Reed-

4、Muench微量法滴定病毒效价，-30°C保存，用于动物接种。1.2.2动物模型的建立36只小鼠分为3组：实验Ⅰ组、实验Ⅱ组每组16只，正常对照组4只。用乙醚完全麻醉后，实验Ⅰ组经鼻缓慢滴入RSV原液（TCID50为10-4.2/100μl），实验Ⅱ组经鼻缓慢滴入100TCID50RSV液，每侧鼻孔各0.1ml；对照组每侧鼻孔给予0.1ml的1640维持液。1.2.3标本的采集于感染后第3、5、7、9d处死小鼠。无菌条件下取出肺组织，左肺一部分用10％中性福尔马林固定，石蜡包埋制成切片，作HE染色观察肺组织病理改变，另一部分用4％戊二醛固定，用于透射电子显微镜下观察肺组

5、织超微结构的改变；右肺置于灭菌Hank’s液中，用于病毒分离。1.2.4肺组织病毒分离无菌条件下取出的肺组织称重后用hank’s液洗2次，按10ml/g加入Eagle液，剪碎新鲜的肺组织标本，研磨后离心5min，收集上清，接种到Hep-2细胞中，观察细胞病变，待细胞融合病变“++”时，记录结果。1.2.5光镜标本结果判定及统计学处理做肺横切面连续切片，每隔100μｍ取切片1张，共取3张。置网格目镜测微尺在400倍镜下，每张切片取10个视野，计数切片上肺泡炎0～Ⅳ级方格数及每张切片内全部支气管数和炎性细胞浸润的支气管数，数据取3张切片的均数。参照Szapiel〔1〕提供的

6、肺泡炎分级，0～Ⅳ级病变确定如下：0级为无肺泡炎；Ⅰ级为肺泡壁间质水肿，毛细血管充血致肺泡壁轻度增厚；Ⅱ级为肺泡壁中度增厚，肺泡腔变小；Ⅲ级为肺泡壁重度增厚，肺泡腔狭小或膨大；Ⅳ级为肺实变。计数资料用率表示，组间比较采用方差分析。2结果2.1病毒效价：在96孔板中滴定病毒效价为104TCID50。2.2肺组织病毒分离：实验Ⅰ、Ⅱ组第5d病毒分离阳性率分别为83.3％、66.8％，第7d分别为62.5％、40.5％，第5、7d实验Ⅰ、Ⅱ组病毒分离阳性率相比分别有显著差异（P0.01）。2.3病理检查结果2.3.1实验Ⅰ组光镜下肺泡出现典型的间质性肺炎表现，肺泡壁明显增厚，

7、毛细血管扩张充血，有较多的淋巴细胞浸润，肺泡腔明显狭窄（见封四图1），病变以感染后第5d最显著，此时Ⅲ级炎症占绝大多数，炎性细胞浸润支气管数接近全部，第7d炎症开始减轻，第9d炎症明显好转，以Ⅰ、Ⅱ级炎症为主，炎性细胞浸润支气管数明显减少，与实验Ⅱ组相比有显著差异（P0.05）。见表1。电镜下可见肺泡Ⅰ型上皮细胞肿胀（见封四图2），形成水泡样，并坏死或脱落；肺泡隔有水肿，淋巴细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞浸润；毛细血管内皮细胞肿胀，形成大小不等的囊泡，有的形成窗隔样裂隙，在病变严重的肺泡腔内，可见富含蛋白的渗液，各种炎症细胞和红细胞；肺泡Ⅱ