p16基因在k562-a02细胞株表达情况的研究

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1、p16基因在K562/A02细胞株表达情况的研究寿倍明，陈宝安，周冬蕊，刘德龙，丁家华，高冲，孙耘　玉王骏，程坚，赵刚，宋慧慧，鲍文，陆祖宏【摘要】目的：研究p16基因在K562/A02细胞株的表达情况及其与耐药的关系。方法：用PCR法对慢性髓系白血病细胞株K562及其耐药细胞株K562/A02进行p16基因缺失检测。结果：K562及K562/A02细胞株经PCR扩增后，均未扩出相应条带。结论：K562/A02细胞株与K562细胞株一样，均表现为p16基因缺失。【关键词】p16基因；K562细胞株；K562/A02细胞株；表达；缺失肿瘤的发生、发展是一个多

2、步骤的过程，其中抑癌基因的失活扮演了重要角色。抑癌基因的失活可以通过多种途径，如缺失、突变、启动子区域的异常甲基化等。p16基因是1994年由Kamb等〔1〕发现的多种肿瘤抑制基因（multipletumorsuppressorgene，MTS1），在细胞增殖周期调控中发挥重要的作用。p16的失活与多种血液系统恶性疾病有着密切的关系，失活的主要方式包括基因缺失、点突变、甲基化、基因重排等。Quesnel等〔2〕报道了p16基因在K562细胞株中是缺失的，而p16基因在K562的耐药细胞株K562/A02中的表达情况目前尚未见报道。本试验拟研究p16基因在K

3、562/A02细胞株的表达情况及其与耐药的关系。1材料与方法1.1细胞培养K562细胞株购自上海细胞生物研究所，用RPMI1640培养基（Gibco公司产品）加10％胎牛血清(杭州四季青公司产品)，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养，48h传代1次，培养中的细胞均保持在(0.1～0.5)×106ml-1的密度。K562／A02细胞株系K562细胞株经阿霉素(ADM)逐步诱导形成，由中国医学科学院血液学研究所提供，培养及传代过程同K562细胞株。1.2方法1.2.1DNA提取实验用细胞为对数生长期细胞，用酚/氯仿抽提法提取基因组DNA，TE溶解，

4、经紫外分光光度计定量，-20℃保存备用。1.2.2PCR引物根据p16基因的核酸序列自行设计，由上海生工生物工程公司合成。引物序列:上游5＇-AAAGAGGAGGGGTTGGTTGGTTATTA-3＇，下游5＇-TACCTGATTCCAATTCCCCTGCAAACT-3＇,β-Globin基因扩增产物为664bp。若扩增出内参照片段而无目的片段，则判为基因缺失。扩增条件:反应体系30μl,其中含10倍PCR缓冲液3μl,Mg2+1.6mmol·L-1,dNTPs200μmol·L-1,引物各1μmol·L-1,模板DNA1μl,TaqDNA聚合酶2U。PC

5、R在GeneAmp2400PCR系统上进行:于95℃预变性5min;95℃变性60s,62℃退火60s,72℃延伸30s,共30个循环。1.2.3电泳观察PCR扩增结束后取5μlPCR产物与1μl电泳上样缓冲液混合后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，条件为200V电泳15min，在凝胶成像系统(Syngene,GeneGenius)观察PCR结果。2结果如图1，从左往右（1～4）依次为对照组（正常人外周血DNA）、Marker、K562细胞株DNA、K562/A02细胞株DNA。显示对照组可扩出内参条带（664bp）及p16基因条带（320bp），K562细胞株

6、和K562/A02细胞株均扩出内参条带而无p16基因条带，证实K562与K562/A02细胞株均为p16基因表达缺失。3讨论p16基因位于人染色体9P21区，全长8.5kb，编码1个含156个氨基酸残基、相对分子质量为15800的蛋白产物，即P16蛋白，它是细胞周期依赖性激酶(CDK)的抑制蛋白。正常情况下P16蛋白与细胞周期蛋白D（CyclinD）竞争结合CDK4、CDK6，抑制两者的活化，未活化的CDK4、CDK6不能解除视网膜母细胞瘤蛋白(pRB)对转录因子的抑制，从而阻止细胞从G1期进入S期，抑制DNA的合成和细胞增殖。当P16蛋白丢失时，Cycl

7、inD和CDK4、CDK6结合就会增多，使肿瘤细胞逃避负性调控，成为恶性生长的重要环节〔3〕。p16抑癌基因是细胞周期调节RB途径中重要的成分，也是该途径受到损害时最易发生遗传学改变的基因之一。在血液系统肿瘤中，p16基因主要在淋巴系统肿瘤中发生改变，在急性淋巴细胞白血病(ALL)特别是儿童ALL中p16基因的缺失可达26％～75％，在急性髓系白血病（AML）中缺失率很低，在慢性髓细胞白血病原始细胞危象期特别是原始淋巴细胞危象期时缺失率可达35％〔4〕。目前血液系统恶性疾病的治疗以化疗为主，但是原发性或获得性耐药仍然是影响化疗效果的重要因素。近年来越来越多

8、的证据证明,肿瘤的耐药不仅与肿瘤基因的扩增、易位、缺失、突变有关，