膠體電泳分析dna片段

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1、膠體電泳分析DNA片段國立中興大學植物病理系張碧芳助理教授前言核酸電泳主要利用核酸帶負電荷的特性，於電場中會穿過膠體，如：agarose或polyacrylamide膠體，而朝向正極移動。因為不同分子量的核酸，在膠體孔徑中移動的速度會有差異，藉此將不同大小的核酸分開。Agarose膠體為較普遍用為電泳的材料，主要因為其製備方便及簡單，常使用在200bp~50kb核酸片段間的分析，且通常以水平式電泳槽來進行電泳。然而，polyacrylamide膠體的製備相較於agarose膠體則較為麻煩，且未聚合前之acrylamide具有神經毒性，可經由皮膚或黏膜吸

2、收，在操作上更應小心。Polyacrylamide膠體電泳可有效分析小分子量的核酸片段，甚至小至1bp，如：核酸定序，一般以垂直式電泳槽來進行。膠體電泳的解析力膠體電泳可分析小至數個核苷酸，大至百萬個核苷酸的染色體DNA，但它也有一定範圍的解析力，並不是一片膠體就可分析各種大小的DNA片段，故要得到好的解析力，必須要探討膠體電泳的解析範圍。常用於分析DNA的膠體電泳有兩種，一種是洋菜凝膠電泳（agarosegelelectrophoresis，簡稱AGE），另一種為聚丙烯醯胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，簡

3、稱PAGE）。這兩種凝膠，由於其濃度不同時，所形成之凝膠體的孔洞不同，故其解析範圍不同。對直線形DNA的有效分析範圍，洋菜膠常用0.3%至2.0%之濃度，可分析於1~60kb（kilo-basepairs或kilo-base）DNA分子（見表一），而聚丙烯醯胺凝膠常用濃度為2.5%至20%，可分析1~1000base或base-pair（bp）長度之DNA（表二）。14（資料來源：曾等，1987）（資料來源：曾等，1987）洋菜凝膠的製備非常簡單，又沒有丙烯醯胺的毒性，故為最常用的膠體，但AGE只適合於分析較大片段的DNA，故在1kb左右或更小的DNA

4、片段，就只好用較不易操作的PAGE。有時為了增加1kb左右DNA的解析範圍，也有使用洋菜凝膠與聚丙烯醯胺凝膠混合膠體作電泳，但其操作更麻煩，而且會因凝聚情況不同而得到誤差的結果。為了方便分析1kb以下的DNA片段，1980年代美國FMC公司製產一種洋菜凝膠，稱為NuSieveagarose，它可配製成1~9%之凝膠，以分析較小片段之DNA分子，其解析力極佳，依不同的凝膠濃度而有不同之解析範圍（見圖一及圖二），但所使用的電泳緩衝液種類也會影響凝膠之解析範圍（見圖一A、B及圖二A、B之比較）。一般常用之電泳緩衝液有三種，其配方如表三，其中以TAE及TBE最

5、常用。選用TAE或TBE緩衝液，對大多數電泳結果，並不造成太大的差異，但某些樣品的分析，有時卻有極大的差異，14（資料來源：曾等，1987）14（資料來源：曾等，1987）14（資料來源：曾等，1987）前述用NuSieve膠體電泳，只是DNA泳動距離（或稱速度）之差異而已，對所得結果之判讀，還不會造成誤差。不過，如果想把AGE分離之DNA片段回收再分析，則必須選用TAE進行電泳，否則對DNA回收率有影響，相反的，分析單股DNA時，卻常選用TBE。電泳技術使用至為方便而可靠，但在分析DNA分子上，一直無法達到分析較大分子的染色體DNA，因此，多年以來，

6、進行基因在染色體上定位的研究，完全依賴遺傳分析或配合顯微鏡的定位分析。最近幾年，由於對電泳電場的試驗分析，已經開發可以用AGE作為分析大於100kbDNA分子。以酵母菌染色體DNA所作分析結果，酵母菌內其中16條染色體之DNA大小在200kb至1500kb間，經由改變電場中電極於某一角度下交互轉換通電之結果，可以達到分離多數染色體DNA的目的，這些設計，包括一種稱為OFAGE（orthogonal-field-alternationgelelectrophoresis），其設計主要是電極以（90∘）直角交互對換通電。另一種稱為FIGE（field-in

7、versiongelelectrophoresis），為定期將電極作180∘轉換，其方式如向前電泳2秒鐘，向後電泳1秒鐘之交換進行。而最好的設計，目前以CHEF（contourclampedhomogeneouselectricfields）電泳，可得到最好的解析力，其設計主要為一六角形之電泳槽之六邊上，圍繞上電極，以120∘14角度交互作電泳。上述這三類之電泳設計，即為一般所稱之脈衝電泳（pulsedfieldgelelectrophoresis），而電泳中之脈衝交互通電之角度以120度之解析力似乎最好。影響電泳的因素核酸在電泳時，其移動速率與分子量

8、大小成對數反比，而與核酸序列的組成鹼基無關。其他影響電泳的因素有：（一）膠體濃度：濃度之高低，