离心沉降分离原理

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1、離心沉降分離原理A、概述利用微生物、動物、或植物細胞生產有機酸、胺基酸、抗生素、特化品、酵素、甚或藥用蛋白質已經是相當成熟的生物技術。不管生產細胞的取得是經由篩選、突變、原生質融合或是基因工程，在量產時通常要給與適當的培養基及培養環境，提高細胞數量並誘導生成產物。產物生成的模式不外乎三類：(1)分泌於細胞体外醱酵液；(2)溶於細胞体內；(3)不溶性胞內包涵體(inclusionbody)。下表為各種生技產品及其生產菌株表現產物的模式：第(1)類產物：分泌於細胞体外醱酵液；有機酸產物如檸檬酸、乳酸，胺基酸產物(如味精、

2、離胺酸，抗生素產物如青黴素、紅黴素)，酵素產物(如糖化酵素、蛋白質分解酵素等)。動物細胞表現藥用蛋白質產品如Erythropoietin則屬第(1)類模式產物。第(2)類產物：溶於細胞体內；一些分子量較大的生化物質如阿巴汀(avermectin)、勃激素(gibberellin)、過氧化氫觸媒酵素(catalase)等。將外來的基因轉殖於宿主微生物表現時，其蛋白質產物無法排出體外，如r-DNA酵母菌B型肝炎表面抗原(HepatitisBsurfaceantigen,HBsAg)，亦屬於第(2)類產物。第(3)類產物：

3、不溶性胞內包涵體；常見於採用基因工程改造的微生物表現高等動物蛋白質的情況。轉殖於宿主微生物的結構基因(structuregene)，被強力的啟動子(promoter)推動而在短時間大量表現蛋白質產物，造成在胞內形成不溶性胞內包涵體，如r-DNA大腸桿菌的胰島素等。產物生產菌株產物特性表現模式分離策略味精，MSGBrevibacteriumdivaricatum胞外，溶於broth之胺基酸小分子(1)去除菌体檸檬酸Aspergillusniger胞外，溶於broth之有機酸小分子(1)去除菌体青黴素Penicilliu

4、mchrysogenum胞外，溶於broth之抗生素分子(1)去除菌体糖化或蛋白質分解酵素Aspergillusniger胞外，溶於broth之酵素大分子(1)去除菌体阿巴汀(avermectin)Streptomycesavermitilis胞內之二次代謝分子(2)取得菌体以利溶劑萃取過氧化氫觸媒酵素(catalase)Bacillussubtilis胞內之酵素大分子(2)濃縮及清洗菌体以利細菌破碎釋出酵素r-DNAHbsAgr-DNASaccharomycescerevisiae胞內之蛋白質大分子(2)濃縮及清洗

5、菌体以利細菌破碎釋出HbsAgr-DNAInsulinr-DNAEscherichiacoli胞內之蛋白質大分子內涵體(inclusionbody)(3)濃縮及清洗菌体以利細菌破碎釋出inclusionbodyr-DNAErythropoietinr-DNACHOcell胞外之蛋白質大分子(1)除去動物細胞下游產品回收的工程包括:菌体分離、細胞破碎及去除、粗分離、純化及製劑配方等步驟。將細胞菌体回收或去除端看產物的生成模式，如青黴素或蛋白質分解酵素，必須除菌取得胞外液；如阿巴汀，必須取菌体後，再行萃取工作；如表現HB

6、sAg的r-DNA酵母菌醱酵液，因為HBsAg生產於酵母菌胞內，在打破細胞釋出產品前，醱酵液中仍含相當多之雜蛋白質宜先行移除，所以必須取菌濃縮及清洗，再行打破。細胞菌体之分離回收方法甚多，但可以量產規模實施，連續及自動化操作的有下列幾種程序:一般過濾、膜過濾、離心沉降、及離心過濾等。本實驗僅就離心沉降做簡單的介紹。B、離心沉降的原理(principleofcentrifugalsedimentation)(1)離心機介紹沉降(sedimentation)乃是利用菌體密度大於醱酵液密度而會沉降於底層的特性來分離菌體。但

7、由於微生物菌体顆粒很小，沉降非常慢，故要提供離心場，來加速沉降速度，稱為離心沉降(centrifugalsedimentation)，亦即離心沉降是利用離心力及物質密度不同的一項分離技術。一般常用的批次離心機(或瓶式離心機，batchcentrifuge)為分析及樣品製備用途，但當規模大於150公升時批次離心機已不適合使用，因此一定要以連續離心(continuouscentrifugation)的設計，方能放大使用。<連續離心機>如下圖，常見之工業用連續離心機有(a)管碗式高速離心機(tubularbowlcentr

8、ifuge)；(b)固体停留盤式離心機(solid-retainingtypediskcentrifuge)；(c)間斷式排渣盤式離心機(intermittentejectiontypediskcentrifuge)；(d)噴嘴式盤式離心機(nozzletypediskcentrifuge)及(e)螺旋式離心機(screwtypedecante