scge技术的原理、流程及其在法医学中的应用方法分析

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1、SCGE技术的原理、流程及其在法医学中的应用方法分析-->SCGE技术的原理、流程及其在法医学中的应用方法分析-法医学论文范文【摘要】关于SCGE技术的原理、流程及其在法医学中的应用方法分析的法医学论文范文：DNA作为生物体内的遗传物质,它的稳定对于生命体的正常繁殖与生长至关重要,然而环境中各种理化及生物因素都可能损伤DNA,从而导致机体相应功能异常,产生各种疾病;同时,随着个体生命和新陈代谢的停止,其细胞中的DNA也逐步降解直到消失。所以,DNA的损伤及降解程度的测定越来越引起人们的重视。测定DNA损伤和降解的方法有很多[1-2],如测定DNA双链断裂的中性

2、蔗糖沉降技术、中性滤膜洗脱技术、脉冲电场凝胶电泳、测定单一DNA氧化产物的高效液相色谱(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC)、荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)、高效毛细管电泳及彗星电泳等。其中彗星电泳(或彗星试验,etassay,或单细胞微凝胶电泳,singlecellgelelectrophoresisassay,SCGE)因其操作简便、快速、灵敏度高等特点而得到了广泛应用。本文对该方法的发展、原理及其应用做一介绍。【关键词】SCGE技术；原理；流程1　SC

3、GE的发展SCGE是一种快速、敏感、简便、廉价的在单细胞水平上检测真核细胞DNA损伤的技术,广泛应用于毒理学、生物学、法医学等领域。1978年Rydberg等最先提出单细胞DNA损伤定量[2],Ostling等[3]于1984年正式提出,并利用该技术在中性条件下检测γ射线引起的DNA双链断裂。1988年,Singh等[4]建立了碱性单细胞凝胶电泳技术,Collins等[5]对其进行了改进。1997年Santos等[6]首次将SCGE技术与DNAFISH技术结合起来,为SCGE技术的应用开辟了新的途径。2001年,Nadin等[7]建立了SCGE银染法,进一步提

4、高了损伤DNA分析的灵敏度。与传统DNA损伤检测方法相比,SCGE具有简便、快速、经济、灵敏、无需放射性标记、所需细胞少等优点,适合于体内外不同类型实验和各种类型细胞DNA损伤的研究。因此,SCGE技术在近几年取得了很大的发展和广泛的应用。2　SCGE技术原理当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时,DNA的超螺旋结构受到破坏,在细胞裂解液作用下,细胞膜、核膜等膜结构受到破坏,细胞内的蛋白质、RNA以及其它成分均扩散到细胞裂解液中,而核DNA由于分子量太大只能留在原位,在中性条件时,DNA片段可进入凝胶发生迁移,而在碱处理和碱性电解质的作用下,

5、DNA发生解螺旋,损伤的DNA断链及片段被释放出来,由于这些DNA的分子量很小,所以在电泳过程中会离开核DNA向阳极移动,形成彗星状的图像,而未损伤的DNA部分保持球形。在一定条件下,DNA迁移距离(彗星尾长)和DNA含量(荧光强度)分布与DNA损伤程度呈线性相关,因此,通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度可定量测定DNA损伤程度。3　SCGE的技术流程和结果分析3•1　技术流程及注意事项材料准备———制备单细胞悬液———制片———细胞裂解———碱化处理———电泳———结果观察———结果分析。SCGE可用于DNA单链或双链断裂的检测,其方法的区

6、别主要在于电泳条件不同。双链断裂检测使用中性SCGE液,单链断裂检测使用碱性SCGE液。(1)单细胞悬浮液的制备:SCGE适于一切真核细胞,样品细胞需要量少。细胞可来自培养的细胞系或从活体组织分离的细胞。实验过程中的细胞数目应该调节至约3•0×105个/毫升。如果细胞数目过高,位于凝胶不同层面的细胞可能会发生相互重叠,难以对其结果进行分析;反之,则很难完成对实验结果进行统计分析。(2)制片:制片过程中,在获得牢固稳定凝胶的同时,避免额外DNA的损伤与修复。(3)电泳条件:SCGE一般选用低电压(0•5-5V/cm))和短时间(5-30m

7、in)。电压过高、电泳时间过长虽然能提高检测灵敏度,但可能会使正常的细胞形成少许拖尾而出现假阳性结果;反之,电压过低、电泳时间过短,受损细胞不会形成拖尾而出现假阴性结果。(4)实验条件:整个实验过程需在低温(约4oC)和避光条件下进行,避免额外DNA的损伤和修复,防止假阳性和假阴性结果的产生。3•2　结果分析荧光染色后的标本应尽快在荧光显微镜下观察。用目镜测微尺直接测定或显微摄像后对负片进行分析,也可用计算机影像分析系统。DNA损伤的测定指标有尾长、总慧长、核DNA直径、尾部光密度、总光密度、尾素及尾惯量等。这些指标各有优缺点。如尾长只在低剂量范围

8、内与损伤成线形关系。尾素与尾惯量被认为