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1、开题报告Restin基因对胃癌裸鼠移植瘤的抑制作用及抗血管活性研究专业：生药学07级研究生：张建永导师：李红玉教授导师组：李锦毅副教授二零零九年四月二十日一国内外研究进展20世纪70年代初,Folkman提出“肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成”。现已证明肿瘤及其转移物的生长、维持必须有新生血管提供氧气和养料,运走代谢产生的有害物质,而且还以旁分泌的形式刺激肿瘤的生长,促进肿瘤细胞进入血液循环,从而向其它组织器官浸润转移。如果抑制新生血管的形成,肿瘤细胞将发生凋亡或坏死。这就为抗肿瘤治疗提供了一条新思路。因此肿瘤的抗血管生成药物
2、研究已经成为热点。目前临床上已有多种抑制新生血管形成药物用于抗肿瘤治疗,如内皮抑素（endostatin）和血管抑素（angiostatin）。1999年，John等在从人血清中纯化内皮抑素时，分离到分子量为20995、19904”和16373的几个肽段。Westenrblot结果表明，这些肽段是胶原XV的C端非胶原序列(NC10)表达产物，称之为内皮抑素相关蛋白(relatedtoendostatin,restin).Restin基因是1999年,Ramchandranetal首先发现了一种血管发生抑制因子,restin位于胶原X
3、V的羧端非胶原结构域,分子质量为20kDa,广泛分布于各种组织基底膜,在结构序列上与内皮抑素有61%的同源性。Ramchandran等在人胚肾组织细胞中提取了人胶原XV的C端片段，并成功构建了质粒pPICZaA-CXV，并在原核系统BL21(DE3)细菌细胞中实现了表达，然后用离心柱法提取并纯化了restin蛋白，western-blot检测了蛋白的表达，并研究中发现restin在体外可抑制血管内皮细胞ECV304及牛肺动脉内皮细胞C-PAE的迁移,特别是抑制因VEGF刺激引发的血管内皮细胞增长,并可抑制肾小细胞癌的小鼠动物模型肿瘤
4、的生长。与内皮抑素组比较，restin虽然不能有效抑制肿瘤细胞的增殖，但可专一有效地抑制内皮细胞的移行.2000年，Sasaki等在哺乳动物细胞中获得了可溶性的重组restin和重组胶原XV的NC10.比较两者在VEGF激活的血管生成中的作用时，发现两者均具活性，但在抑制FGF-2激活的血管生成中的作用时，他们发现胶原XVNC10可有效抑制FGF-2激活的血管生成，而restin的抑制作用则要低于NC10.他们认为，这可能由于NC10中的其它区域(结合区或铰链区)具有使内皮抑素样结构域接近作用底物的作用.具体的作用机制还需进一步的实
5、验证明。徐韧等在试验中应用鼠源restin蛋白，片段大约为560bp发现其可抑制牛主动脉弓源内皮细胞BAE的增殖，并可阻滞BAE于G0/G1期，还可诱导内皮细胞凋亡。徐韧等在实验中克隆并表达了人源XV的c端的restin,在小鼠移植瘤实验中,restin基因可使肝癌移植瘤体积缩小2/3,并抑制肝癌转移灶的生长。2002年张革等用RT-PCR法从中国人胎盘组织中扩增hRS基因,重组入pGEM2T载体中并测序鉴定,构建原核表达载体pGEX-hRS,表达融合蛋白GST-hRS。融合蛋白经亲和纯化及凝血酶切后,采用鸡胚绒毛膜尿囊膜试验检测其
6、抗血管生成活性。结果发现RT-PCR产物为564bp,测序结果与Genbank中胶原XV(COL15A1)的C端序列一致,但在21位(TCT→TCG)引起丝氨酸的同义突变,82位(ACA→TCA)引起丝氨酸突变为苏氨酸。诱导表达的人GST-hRS融合蛋白经凝血酶切后,分子量为20kD,能有效地抑制鸡胚新生血管的形成，并具有抗血管活性。二研究依据、目的和意义（一）研究依据肿瘤生长和转移具有明确的血管依赖性,如果没有新生血管的形成,肿瘤细胞只能靠周围组织的弥散获得氧气和养料,其生长将受到明显限制,一旦在瘤灶内及周围形成新生血管,肿瘤细胞
7、就可经新生血管运输获得充足的营养物质而迅速生长;并通过血液循环把肿瘤细胞运输到他处,抗肿瘤血管生成能抑制结肠癌、肺癌、鼻咽癌[8]等恶性肿瘤.有研究表明,肿瘤细胞自身产生的VEGF是重要的促血管生长因子,可通过与其受体VEGFR1、VEGFR2结合,胞内信号传导,诱导血管内皮细胞增殖和促进内皮细胞迁移,增加微血管通透性,加速血浆蛋白外渗,最终导致新的基质及新生管腔形成.因此应用转基因方法将血管生成抑制因子转入靶细胞,可以在肿瘤组织周围创造抑制血管生成的微环境,使肿瘤病灶局部形成较高的药物浓度,有效抑制肿瘤生长。国内外研究均发现，人源
8、Restin基因可抑制血管内皮细胞的迁移及诱导凋亡的作用，具有较强的抗血管生成活性，并可抑制肾癌、肝癌等恶性肿瘤的生长，并可抑制其转移及转移灶的生长。其机制与抑制VEGF的表达等有关。但其在胃癌中的作用及不同肿瘤的抗血管的机制还不甚清
