乙酰肝素酶与大肠癌浸润、转移和血管生成的相关性

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1、乙酰肝素酶与大肠癌浸润、转移和血管生成的相关性【摘要】目的探讨乙酰肝素酶与大肠癌浸润、转移和血管生成之间的关系。方法应用原位杂交方法检测乙酰肝素酶mRNA在95例大肠癌组织中的定位及表达。并用免疫组化方法对全部标本进行CD105染色，记数肿瘤微血管密度（microvesseldensity,MVD）,分析乙酰肝素酶mRNA表达与大肠癌浸润、转移和MVD之间的关系。结果95例大肠癌组织中,乙酰肝素酶mRNA阳性表达49例（51.57％），MVD平均值为（72.1±20.6）；阴性表达46例（48.42

2、％），MVD平均值为（41.3±12.4），差异有统计学意义(P<0.01)。乙酰肝素酶mRNA表达与大肠癌组织浸润深度、淋巴结转移及MVD有关(P<0.05)。结论乙酰肝素酶可促进大肠癌的浸润、转移和血管生成，可作为反映大肠癌生物学行为的客观指标。【关键词】乙酰肝素酶；大肠癌；血管生成；转移乙酰肝素酶是近年来发现的肿瘤的重要功能酶,是体内惟一能够降解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparinsulfateproteoglycan,HSPG)的一种βD葡萄糖醛酸内切酶，可以在特定部位裂解H

3、SPG，促进肿瘤的浸润、转移和微血管形成[1]。自从人类乙酰肝素酶基因被分离以来,人们发现它与许多恶性肿瘤的浸润转移和微血管形成有关[24]。大肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一,乙酰肝素酶mRNA表达是否与大肠癌的侵袭性生长、淋巴结转移和血管形成有关,国内尚未见报道。我们应用原位杂交方法，对95例大肠癌组织，进行乙酰肝素酶mRNA检测和肿瘤微血管免疫组化染色，计数肿瘤微血管密度（microvesseldensity，MVD），探讨乙酰肝素酶与大肠癌浸润、转移和血管生成之间的关系。1资料和方法1.1标

4、本来源收集本校病理学教研室及开封市第一人民医院病理科2000～2004年大肠癌手术切除标本共95例，其中男58例，女37例，年龄25～70岁，平均（56±10.8）岁。所有病例术前未经任何化疗和放疗。肿瘤组织学分级分型均根据全国大肠癌病理研究统一规范，高分化癌15例，中分化癌45例，低分化癌35例；侵及至肌层者25例，侵及浆膜层及浆膜外者70例；Dukes分期属于A期10例，B期15例，C期62例，D期8例。大肠癌同时伴有淋巴结转移者63例，无淋巴结转移者32例。标本均经10%中性缓冲福尔马林固定，

5、常规石蜡包埋，连续切片。检测mRNA标本所用载玻片均经APES处理，0.1％DEPC水浸泡。所用标本均经病理学明确诊断。1.2免疫组织化学染色标本均经10%福尔马林固定，连续切片，分别作HE及免疫组化染色。CD105单克隆抗体由SantaCruz生物技术公司生产。按常规SP法进行，石蜡切片常规脱蜡至水后，微波抗原修复，0.3%H2O2甲醇封闭内源性过氧化物酶。DAB显色，苏木素复染、脱水、透明、封片、光镜下观察。每批染色均设阴性对照和阳性对照，阳性对照为已知阳性组织片，阴性对照用PBS代替一抗。1.

6、3肿瘤MVD记数参照VD，5个区域的均值为该肿瘤的MVD值。1.4探针标记采用PrimerPremier5.0软件设计反义寡核苷酸链，共35个bp(5′＞CTTGCCTCATCACCACTTCTATTCCCATTCGGCTT＜3′)，由上海生物工程公司合成。取1pmol量，采用德国保灵曼公司加尾寡核苷酸探针标记试剂盒，标记出1μg加尾反义寡核苷酸探针。1.5乙酰肝素酶mRNA原位杂交①组织切片预处理：切片66℃烤片过夜，至新鲜二甲苯中20min脱蜡，逐级0.1％DEPC稀释乙醇至水，0.2mo1/L

7、HCl酸化，5m1/L蛋白酶K37℃消化20min。0.01MPBS(pH7.4)冲洗3次。②杂交：在组织上滴加预杂交液，2×SSC湿盒内预杂交3h。每片组织滴加浓度为50ng/ml的乙酰肝素酶地高辛标记探针20μl，至2×SSC湿盒42℃杂交过夜。③洗涤、显色：杂交后分别用2×SSC、0.5×SSC、0.1×SSC洗涤5min×3次，37℃封闭20min，滴加生物素化鼠抗地高辛抗体，37℃、60min，0.01MPBS洗涤3次，滴加SABC37℃、20min，DAB显色20min终止，充分水洗。苏

8、木精复染，脱水、透明、封片。同时以子宫平滑肌瘤为阴性组织对照标本，黑色素瘤转移淋巴结为阳性对照，以预杂交液代替探针作为空白对照。1.6结果判断原位杂交的阳性信号位于胞浆中，阳性信号为棕黄色，呈颗粒状。阳性细胞＜1％为阴性。1.7统计学处理采用SPSS10.0软件进行分析，对实验结果采用χ2检验和t检验。2结果2.1乙酰肝素酶mRNA在大肠癌中的表达用原位杂交法检测95例大肠癌组织。结果表明，乙酰肝素酶mRNA棕黄色颗粒阳性信号在癌细胞胞浆内。95例大肠癌组织中，阳性4