异种脱蛋白骨复合物修复大段骨缺损的血管化观察论文

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1、异种脱蛋白骨复合物修复大段骨缺损的血管化观察论文简月奎，李起鸿，刘雷，杨柳【摘要】［目的］探讨异种脱蛋白骨(heterogeneousdeproteinbone，HDPB)复合物修复胫骨大段骨缺损过程中的血管化实验研究，为异种脱蛋白骨的临床应用提供实验依据。［方法］山羊24只，在右侧胫骨中下段截除胫骨总长度20％形成节段性骨缺损，实验组18只.freelmHg真空下包装，60Co照射后置-4℃保存。DPB于术前浸入含rhBMP2浓度为75ng／ml［3］溶液中2h备用。1.3实验动物分组山羊(第三军医大学动物实验中心提供)，10～12个月龄，雌雄不限，分笼喂养，体重(22.5±2.5)

2、kg。随机均分2组，按植入材料分为实验组(异种DPB+自体MSCs+rhBMP2)和对照组(自体骨)。1.4山羊MSCs培养及与异种DPB复合分离培养、收集山羊MSCs，调整细胞浓度为1.0×106／ml，将细胞悬液接种于异种DPB／rhBMP2上，2ml／块，放入37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养6h再加含15％FBS的DMEM／F12培养基1ml，2～3d后常规换液。1.5动物手术术前拍双侧胫骨X线片，测量胫骨干长度，所有动物骨缺损制备和外固定相同，操作由同一组人员完成。半环槽式外固定器固定，所有螺母旋紧。根据X线片得到的胫骨长度，右侧胫骨中下段造成20％骨和骨膜段缺

3、损［4］，据分组植入不同的植入物，其中MSCs均来自山羊自体骨髓。术后每隔4周摄肢体正侧位X线片。肌注速眠新0.08ml/kg，麻醉后固定，常规条件摄片。1.6配制墨汁及灌注市售墨汁过滤后，按7∶2∶1的比例将墨汁、10％甲醛和20％甘露醇混合配制成灌注液，6层医用纱布过滤，用前恒温水浴加热至38℃。速眠新0.08ml／kg与氯胺酮2mg/kg肌肉注射复合麻醉后固定，肝素1000U／kg肌注全身肝素化，在腹股沟区切开皮肤、皮下组织，游离股、静脉。结扎股动脉、离断，远端插管、固定；结扎股静脉、离断，远端切开放血。快速向股动脉远端推注大量肝素生理盐水(每500L生理盐水中加入肝素12500

4、U)冲洗直至股静脉流出清亮液体为止。然后从股动脉注入38℃墨汁灌注液至股静脉流出黑色液体，皮肤趾甲变黑，结扎股动、静脉。处死山羊，取下胫骨，低温放置24h后10％甲醛溶液中固定2周。进行大体解剖及厚切片观察新骨血管化情况。1.7大体解剖观察切开皮肤，暴露皮下组织和肌肉及剔除肌肉暴露骨膜，观察皮下组织、肌肉和骨膜血管网。1.8墨汁灌注厚切片血管计数和血管面积图像分析观察取不同时间点新骨2％EDTA脱钙，以针刺时似软组织手感后，香柏油浸泡5d。切取脱钙后新骨不同层面的横、纵切面，制成50～100μm厚切片，每个标本分别随机抽取新骨两端及中间的横切片各5张，观察新骨血管网，并用Imagep

5、roplus真彩图图像分析软件测量血管数目和面积。1.9统计方法采用SPSS13.0统计软件进行数据处理，数值以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析进行比较。2结果2.1术后观察所有实验山羊术后伤口无溃烂、流脓，无死亡。2～6h苏醒，并能站立进食。螺母松动后及时旋紧，无外固定松动失败，皮肤无坏死。2d内伤肢能落地，但不能负重，2周后可以部分负重，3周能轻微跛行，4周后能自由活动，无跛行。2.2大体解剖观察肌肉和软组织已经被墨汁黑染，皮下、肌肉筋膜和骨膜可清楚的观察到血管大小、分支、走行方向及相互吻合呈网状。2.3影像学观察术后4周骨缺损区出现植入物边缘毛糙，8周出现大小不等、形

6、状不规则的透光性骨吸收区。术后12、16、20、24周，2组表现为时间依从性的骨修复，表现为骨缺损区两断端之间高密度钙化影，新生骨与两断端完全相连接，大部分塑形，可见髓腔影(图1)。2.4墨汁灌注后切片观察术后4周，实验组新骨边缘血管纤细，数目较多，显影不清，分布不均，中心部分血管缺如，中心与边缘分界明显(图2)；术后8周，新骨中心部分出现纤细小血管，数目较少，分布不均，中心边缘分界较明显(图3)。12周新骨中心部分血管粗细不一，血管扭曲，分布也不均匀，排列紊乱，中心与边缘分界较明显(图4)。16～24周新骨血管数目逐渐多，相对均匀，吻合成网，排列趋向规则(图5～7)。在同一时间点，对

7、照组与实验组图像相似，但对照组血管数目略多，分布相对均匀，排列相对规则。Imageproplus真彩图图像分析软件测量血管数目和血管面积统计学分析如表1。4～24周，不同时间点血管数目(表1)和面积(表2)两者统计学分析差异无显著性意义(P0.05)。表12组术后不同时间点新骨血管数目比较（略）2组比较：▲P0.05表22组术后不同时间点新骨血管面积比较（略）两组比较：▲P0.053讨论异种骨的应用主要是免疫原性和成骨能力，而移植后的血管化及