四个不结球白菜自交不亲和s单元型分子鉴定

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1、四个不结球白菜自交不亲和S单元型分子鉴定李霞，胡侦华，周国林，汪爱华（武汉市蔬菜科学研究所武汉蔬菜展示中心，４３６４００）摘要：利用已报道的ＳＲＫ及ＳＬＧ基因序列保守区设计的特异性引物，通过ＰＣＲ扩增和克隆测序，结合生物信息学分析方法对４份国外引进的不结球白菜（Ｂｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｓｓｐ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓＭａｋｉｎｏ）自交不亲和材料的Ｓ单元型进行分子鉴定。结果表明，不亲和材料Ａ１包含的Ｓ位点基因序列与甘蓝（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａＬ．ｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａＬ．）ＳＬＧ－３１的相似度为９８％（

2、Ｅ值是０）；不亲和材料Ａ２、Ａ３包含ＣｌａｓｓＩ类及ＣｌａｓｓⅡ类２种Ｓ单元型，Ｓ位点处于杂合状态。不亲和材料Ａ４包含的Ｓ位点基因序列与青花菜（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａＬ．ｖａｒ．ｉｔａｌｉｃａＰｌｅｎｃｋ）单倍型ＢＯＩ１ＳＲＫ蛋白基因具有９８％的序列相似度，序列覆盖度达９９％。.jyqkin；94℃变性30s，５２℃退火３０ｓ，７２℃延伸９０ｓ，３５个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ，２５℃保存。在１．０％琼脂糖凝胶中进行电泳产物检测，紫外凝胶成像系统拍照。１．２．４目的片段的回收及克隆利用ＰＣＲ产物回收试剂盒对目

3、的片段进行回收，将回收ＤＮＡ片段连接到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，转化到感受态大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）上，进行蓝白斑筛选，对阳性克隆进行ＰＣＲ鉴定。１．２．５测序及序列分析对于鉴定的阳性克隆送样测序，每个样品测定２～３个阳性克隆，测序由上海生工生物工程技术服务有限公司实施。序列分析利用ＤＮＡｓｔａｒ软件完成；Ｂｌａｓｔ分析通过ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）在线进行。２结果与分析２．１Ｓ单元型相关基因的ＰＣＲ扩增利用芸薹属ＣｌａｓｓⅠ类Ｓ单元型ＳＬＧ基因特异性

4、引物组合ＰＳ５＋ＰＳ１５及ＣｌａｓｓⅡ类ＳＲＫ基因特异性引物组合Ｐ３＋Ｐ４对４份自交不亲和材料Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４进行ＰＣＲ扩增，结果见图１。从图１可见，Ａ１材料只在ＰＳ５＋ＰＳ１５引物组合中有扩增产物，Ａ４只在Ｐ３＋Ｐ４引物组合中有扩增产物，而Ａ２、Ａ３在２对引物扩增条件下都有特异性条带出现。以上结果表明，Ａ１可能属Ｓ单元型中的ＣｌａｓｓⅠ类，Ａ４则属于ＣｌａｓｓⅡ类Ｓ单元型。Ａ２和Ａ３的扩增结果表明在这２份不亲和材料中很有可能包括了２类Ｓ单元型，在Ｓ位点表现为杂合类型。为了进一步对以上结果进行验证，对

5、上述４份自交不亲和材料中扩增出的目标片段进行回收，并分别连接到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，进行大肠杆菌转化，挑取阳性克隆进行序列测定。２．２自交不亲和材料扩增序列的Ｂｌａｓｔ分析将４份自交不亲和材料扩增产物的ＤＮＡ序列测定结果与ＮＣＢＩ已登录的芸薹属核苷酸序列进行Ｂｌａｓｔ比对，以进一步确定它们的Ｓ单元型。Ｂｌａｓｔ分析表明，自交不亲和材料Ａ１由ＰＳ５＋ＰＳ１５引物所扩增出的１３５６ｂｐ的片段经克隆测序结果比对后发现，其与甘蓝（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａＬ．ｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａＬ．）ＳＬＧ－３１（ＧｅｎＢａｎｋ登录

6、号ＡＢ０５４７２９．１）在序列覆盖率为９４％的情况下，相似度为９８％（Ｅ值是０）。而与白菜Ｓ位点蛋白１基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＨＭ６２９３３８．１）在序列覆盖度为８０％的情况下，与其ＣＤＳ序列相似度达到了９９％（Ｅ值是０）。以上结果显示，自交不亲和材料Ａ１的Ｓ位点基因序列在较高的序列覆盖度情况下，与甘蓝ＳＬＧ－３１具有较高的相似度；而与白菜蛋白基因１所属的Ｓ单元型在较低的序列覆盖度下序列相似度更高。因此，要准确鉴定其Ｓ单元型，需要进一步的试验来验证。自交不亲和材料Ａ２在２对引物扩增条件下都有扩增条带产生，

7、包括１３５６ｂｐ及１０４６ｂｐ２条特异性扩增条带。对１３９４ｂｐ的序列进行比对后发现，该序列与白菜的Ｓ位点糖蛋白ＳＬＧ－３０基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号Ｄ８５２１７．１）及芜菁（Ｂ．ｒａｐａＬ．ｓｓｐ．ｒａｐｉｆｅｒａＭａｔｚｇ）的Ｓ位点受体激酶基因ＳＲＫ－３０（ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＡＢ０５４６９３．１）的序列具有很高的相似度，分别为９９％和９８％。因此基本可以确定不亲和材料包含Ｓ３０这一单元型。对１０５９ｂｐ片段的序列比对后发现，其与芜菁ＳＲＫ－６０、ＳＬＧ－６０基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＡＢ０９７１１６．

8、１）在覆盖度为９９％的情况下，相似度也高达９９％，远远高于其他单元型，因此可以确定该序列属于Ｓ６０单元型。所以自交不亲和材料Ａ２基本上可以确定其具备Ｓ３０、Ｓ６０这２种Ｓ单元型，再一次证明自交不亲和材料Ａ２在Ｓ位点为杂合状态。自交不亲和材料Ａ３也如Ａ２材料，在ＣｌａｓｓⅠ类及ＣｌａｓｓⅡ类Ｓ单元型引物中都扩增出了对应的目的条带，分别为１３５６ｂｐ及１０４６ｂｐ。对２条序列的分析结果表明，前者与萝卜（Ｒａｐｈａｎｕ