四川省卫生厅科学研究项目申报书

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1、四川省卫生厅科学研究项目申报书项目或课题名称：骨髓间充质干细胞立体成软骨诱导培养及工程化软骨构建的实验研究申报单位泸州医学院附属医院协作单位泸州医学院心肌生理实验室项目或课题负责人研究起止年限2005.8～2008.8通讯地址泸州市太平街25号联系电话028—2869888申请日期2005.3.16卫生厅项目编号四川省卫生厅二OO五年制一、研究目的和主要研究内容研究目的：研究兔骨髓间充质干细胞立体成软骨诱导分化情况，构建特定形态的组织工程化软骨。主要研究内容：1.提取、分离、纯化兔骨髓间充质干细胞，并对其进行原代、传代的细胞扩增培养。将

2、获得的原代和传代培养的兔骨髓间充质干细胞，在成软骨诱导剂下采用支架进行三维成软骨诱导培养，对诱导培养细胞－支架复合体块进行大体观察、HE染色、阿新兰染色、甲苯胺兰染色检测软骨细胞基质的合成，并进行免疫组化及以RT-PCR检测诱导后的细胞II型胶原的表达。2.上述细胞－支架复合体在经成软骨诱导因子体外诱导培养3周后，将该细胞－支架复合体植入裸鼠体内继续培养，以构建工程化软骨。分别在植入后第6、10周将植入物取出，采用大体观察、HE染色、阿新兰染色、甲苯胺兰染色，免疫组化以及原位杂交等鉴定构建的组织的软骨分化情况。二、研究背景和依据（国内外

3、研究现状、发展趋势、必要性、新颖性、创新点、研究意义）研究必要性：软骨与骨不同，在体内的再生能力很差，一旦因各种原因损伤，软骨难以自身修复，最终软骨缺损、造成功能病废。自Hunter首先认识到这一现象以来，针对软骨修复的研究已有250年的历史[1]。对于严重的软骨损伤与缺损，虽然软骨移植或骨软骨移植有较好的软骨修复效果[2]，但因供体来源有限，妨碍了这种方法的广泛应用。而软骨细胞移植存在细胞悬液容易在移植区流失的问题[3]，另外，虽然骨膜移植或软骨膜移植以及支架材料充填等方法都能在软骨损伤、缺损处形成修复组织，并缓解临床症状，但通常修复

4、组织质量较差，常为纤维软骨，常常不能达到长期恢复功能的效果[4]，因此寻找组织工程化软骨十分必要。国内外研究现状和发展趋势：近年来，基于组织工程和基因工程技术发展起来的细胞或组织替代治疗是整个生命科学领域中的研究热点和前沿，为人类征服多种疾病提供了新的途径和希望。组织工程的研究主要包括以下三个方面：种子细胞的离体培养研究，细胞外基质替代物（生物材料）的研究，组织工程化组织的构建研究。其中对离体培养的种子细胞的要求是①取材方便；②在体外应用有较强的增殖能力；③能适用材料和受区环境；④能在受区完全替代缺失细胞的功能。软骨细胞在软骨组织工程中

5、应用研究起步较早，研究较多，但研究发现有如下的缺点：自体来源的软骨细胞有限，且随着年龄增大，获得的软骨细胞数量减少，取材不便，对供体部位造成一定伤害，同种异体或异种来源的软骨细胞，不但来源有限，而且易于造成疾病传播。所以，选择能满足要求和易于操作的靶细胞又是组织工程的一个关键的问题。骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcellsderivedfrombonemarrow,MSC）,是中胚层发育的早期细胞，在1867年,Cohnheim在实验中给动物静脉注射一种不容性染料analine，结果在动物损伤远端的部位发现含有染料的细

6、胞，包括炎症细胞和与成纤维合成有关的成纤维细胞，并认为这些细胞来自骨髓，这是最早提出骨髓具有造血外还有其他功能的报道[5]。但受到当时条件的限制，这些研究未能深入进行。直到20世纪70年代，研究人员开始重新认识到骨髓中这种造血以外的细胞的意义并开展了相关的研究。Friedenstein等[6]在1971年实验中发现塑料培养皿中培养的貼壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞经过10个培养周期仍能保持其多向分化潜能，后来，证明这类细胞就是骨髓间充质干细胞，将这些细胞植入小鼠的腹腔可以形成

7、软骨样或骨样组织[7]。这些工作对骨髓间充质干细胞的研究具有重要的意义，进一步证实了骨髓间充质干细胞的存在，并创建了一种较经典的分离此类干细胞的方法，该方法后来得到了较广泛的应用。研究的创新点及其意义：骨髓间充质干细胞的多方向分化具有高度的进化保守性，人、狗、兔、猪、大鼠和小鼠，甚至禽类的骨髓的间充质干细胞均有相似的特点[8]。如今，针对骨髓间充质干细胞进行分离、纯化、培养的条件正在不断进行优化[9]，同时也在不断优化骨髓间充质干细胞向成骨细胞和成软骨细胞的诱导培养条件和方式，探讨骨髓间充质干细胞在骨和软骨损伤中的应用的研究已显示出良好

8、的前景。由于骨髓间充质干细胞来源不受限，取材方便，对供体损伤小，易于通过梯度离心和体外貼壁培养法分离培养，而且其体外增殖能力强，易于进行基因修饰，并易于调整骨髓间充质干细胞表达所需的细胞因子，因此，有的学者