牙龈卟啉菌蛋白酶rgpacd基因表达载体的构建论文

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1、牙龈卟啉菌蛋白酶rgpAcd基因表达载体的构建论文许静，李昂，苟建重，许援朝，饶国洲，刘蒸，谢红帼【关键词】牙龈卟啉菌摘要：目的构建牙龈卟啉菌蛋白酶rgpA催化结构域(rgpAcd)基因的表达载体。方法利用PCR技术和基因重组技术，克隆牙龈卟啉菌蛋白酶rgpAcd,插入中介载体pMD18T中并测序鉴定。将目的基因片断插入原核表达载体pET15b.freelainofrgpAcdofporphyromonasgingivalis(Pg).MethodsThedesiredDNAfragmentrgpAcdentententidedb

2、yenzymesdigestion,itshoidlayssolidfoundationforfutureanimalexperimentsandclinicaltrials.KEYD18TVector(Takara)、原核表达载体pET15b(Novagen)。1.2主要试剂rTaqDNAPolymerase、限制性内切酶及DNAMarkerDL2000、DNAMarkerDL15000、Xgal和IPTG(Takara)；DNAMarkerⅥ、DNAMarkerⅦ、细菌基因组DNA提取试剂盒、离心柱型质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶

3、DNA回收试剂盒(北京天为时代科技有限公司)。1.3实验方法1.3.1细菌DNA的提取PgATCC33277用改良GAM培养基1mg/L维生素K1、5%(体积分数)脱纤维蛋白羊血，在37℃厌氧条件下(体积分数：80%N2，10%H2，10%CO2)培养5d，接种2-3个平皿，刮下细菌，离心收集菌体，-20℃保存备用。采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取PgDNA。获得的DNA采用紫外吸收法作定量和纯度检测。1.3.2PCR扩增特异性基因片断以Pg基因组DNA为模板，根据Pavloff等报道的PgrgpA基因序列(GI：557067)

4、，设计rgpAcd引物，上游包含NdeⅠ酶切位点和起始密码子ATG，下游包含终止密码子TGA。上游引物的序列为5′CATATGTACACACCGGTAGAGG3′(22bp)，下游引物的序列为5′TCAGCGAAGAAGTTCGGGGGCA3′(22bp)。由上海生工生物工程技术公司合成。用rTaq酶扩增rgpAcd基因，PCR反应体系为50μL。反应条件：94℃预变性5min，进入热循环――94℃变性30s，55℃复性1min，72℃延伸2min30s。共35个循环后，再72℃延伸20min。将PCR产物进行10g/L琼脂糖凝胶

5、电泳分析。1.3.3PCR产物的克隆和重组质粒的鉴定PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，与pMD18TVector连接进行T/A克隆，以连接产物转化E.coliTOP10感受态细胞，涂碟，进行Xgal/IPTG蓝白斑筛选。挑选白色克隆，摇菌，用离心柱型质粒小提试剂盒提取质粒，用BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定。酶切正确的阳性克隆送上海生工生物工程技术公司测序。正确的重组质粒命名为pMD18T/rgpAcd。1.3.4原核表达质粒pET15b/rgpAcd的构建和鉴定分别将已构建并经测序鉴定的pMD18T/rgpAcd用Bam

6、HⅠ/SalⅠ双酶切，原核表达载体pET15b用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切，低熔点胶回收酶切片段后，以T4连接酶连接，转化至E.coliTOP10感受态细胞中，对阳性菌落进行酶切鉴定。正确的原核表达质粒命名为pET15b/rgpAcd。2结果2.1PgATCC33277DNA的定量及纯度经紫外吸收法测定，A260/A280=1.76，说明DNA纯度较高，基本没有RNA及蛋白污染。DNA质量浓度为68mg/L。电泳结果显示所获得DNA纯度较高，且DNA链大于15kb(图1)。图1Pg基因组DNA电泳图（略）2.2PCR产物的获得PC

7、R产物电泳，在大约1.5kb处有一特异的条带，与预期的大小(1476bp)一致(图2)。图2PCR产物电泳图（略）2.3重组质粒的鉴定以TA法将PCR产物克隆至中介载体pMD18T中，重组质粒pMD18TrgpAcd经BamHⅠ和SalⅠ双酶切，与预期相符(图3)。测序结果同GenBank中收录的序列完全一致，未发生任何突变。图3pMD18T/rgpAcd重组质粒BamHⅠ/SalⅠ双酶切图（略）2.4表达质粒的构建与鉴定重组质粒pMD18TrgpAcd用BamHⅠ和SalⅠ双酶切出所需片段，定向插入经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切的

8、原核表达载体pET15b中，构建表达质粒pET15b/rgpAcd，该重组质粒经NdeⅠ酶切后，与预期大小一致(图4)，表明成功构建表达质粒。图4pET15b/rgpAcd表达质粒NdeⅠ酶切图（略）3讨论目前有关牙周炎的免疫学研究主要包括主动免疫