mrna及蛋白质的检测分析技术

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1、mRNA及蛋白质的检测分析技术-->mRNA及蛋白质的检测分析技术移植肾损伤的分子病理学研究已经超出局部病理变化的范畴,正在向局部分子改变和组织学改变相结合、代写硕士论文局部分子改变与体液分子改变及血细胞分子改变相结合的多元化分子研究发展[1]。目前研究分子病理的常用方法普遍适用于移植肾损伤的分子病理学研究。1.　DNA检测分析技术分子生物学技术的发展,使人们对移植免疫等方面参与移植肾损伤的分子的核苷酸碱基序列的了解越来越清楚。体外基因扩增技术—PCR方法的创立及其在生物医学中的应用,使得从DNA水平研究移植肾损伤成为可能,并已在临床器官移植研究中实际应用。检

2、测DNA的方法多种多样,根据不同的用途各有其特点。目前常用的可大致归纳为如下几大类型[2]。1.1　Southern印迹法(Southernblot)　将一定量的DNA样品用适当的限制性内切酶切割成不同长度的DNA片段,然后在琼脂糖凝胶上进行电泳分离,如加样量相等,酶解适当,则在用溴化乙锭染色时,应显示长度及亮度均相等的DNA拖带。用于检测DNA的已知探针,一般由带有该片段的细菌质粒中制备。纯化的探针DNA一般用放射性同位素32P或生物素、地高辛配基等标记。杂交前探针必须加温至100℃变性处理。杂交后的膜在暗盒中进行放射自显影后,即在一定的位置显示同标记探针特

3、异地结合的阳性DNA条带。Southern杂交法可检测基因的存在及其扩增,也可检测基因的杂合性丢失。1.2　聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)技术　PCR是一种由特定寡核苷酸引物(primer)介导的特异基因或克隆序列的体外酶促扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。该方法一改传统分子克隆技术的模式,不通过活细胞,操作简便,可以将数量很少的原始模板DNA分子进行几何级数的倍增,扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定,能最大程度地满足科学家操作DNA的要求。因此,在其问世后的十多年里,PC

4、R技术得到了迅速发展。在经典PCR基础上发展了RT-PCR,以RNA为模板,首先逆转录成cDNA,然后进行正常PCR循环扩增。近年来,PCR技术得到进一步发展,并建立了一系列PCR扩增新技术,如反向-PCR、锚定-PCR、原位-PCR、巢式-PCR、重组-PCR、定量-PCR等。据此,在移植肾损伤的分子机制研究中,利用很少的活检组织细胞或体液,在获取少量模板DNA的情况下,即可应用PCR技术研究待测基因的表达。1.3　聚合酶链反应寡核苷酸探针杂交方法(PCRationpolymorphism,PCR-SSCP)　PCR-SSCP系Drita等1989年首先提出

5、,其原理可概括为:在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,单链DNA因碱基序列不同所形成的构象不同。通过PCR扩增包括发生单个碱基置换部位及两侧DNA片段,变性后进行SSCP分析,从理论上讲可分辨出单个碱基的改变,有效地检出点突变和DNA的多态性,并且已经用于肾移植术后排斥反应的分子病理研究[3]。1.5　顺序特异引物聚合酶链反应技术(PCRers,PCR-SSP)　PCR-SSP方法的基本原理是根据待测基因的核苷酸序列,设计出一系列针对各亚型的顺序特异引物,通过PCR扩增各等位基因的型别特异性DNA片段;扩增产物仅需借助常规的琼脂糖凝胶电泳,即可根据是否存

6、在特异性扩增产物的电泳条带直接进行基因检测。1.6　原位聚合酶链反应(insituPCR)　利用PCR技术,不仅可以在聚丙烯管中对含有多种模板的材料进行PCR,也可以在病理切片或细胞显微波片上对标本进行待测基因的DNA原位扩增,可称为玻片PCR(Slide-PCR)。其特点是不经过模板提取过程,在组织或细胞原位进行PCR扩增,要求在具备原位PCR扩增条件的PCR仪和原位扩增系统中进行,扩增物可作原位杂交显示,可以结合病理组织学分析,判定病理改变与某个或某些基因的关系。2.　mRNA检测分析技术2.1　原位杂交技术　原位杂交(insituhybridizatio

7、n,ISH)是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异结合,形成杂交体,然后再应用与标记物相应的检测系统,通过组织化学或免疫组织化学方法,在核酸原有的位置进行细胞内定位。是研究单一细胞中编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位的手段,是从分子水平研究细胞内基因表达及其调控的有效工具。适用于肾移植后不同病理损伤的mRNA表达的研究及检测,具有定位准确,病理分析与分子改变同步显示的功能。2•2　Northern印迹法　Northern印迹(Northernblot)原理与Southernblot基本相同。所

8、不同处在于,RNA远不如DNA稳定,很