离体保存技术方法.docx

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1、离体保存技术方法种质是亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质。种质资源保存是指在天然或人工创造的适宜环境条件下，贮存植物种质，使其保持生命力与遗传性的技术。种质保存的方式有原地保存和异地保存。原地保存主要通过建立自然保护区、天然公园来实现种质保存的目的；异地保存则通过建立植物园、种质资源圃、种子库以及离体保存等方法来实现。离体保存是将单细胞、原生质体、愈伤组织、悬浮细胞、体细胞胚、试管苗等植物组织培养物储存在使其抑制生长或无生长条件下，达到保存目的的方法。离体种质保存有以下优点：①占空间少，节省大量的人力、物力和土地；②便于种质资源的交流利用；③需要时，可以用离体培养

2、方法很快大量繁殖；④避免自然灾害引起的种质丢失。离体种质保存的不足之处：①对于限制或延缓生长的处理，需定期转移，连续继代培养；②易受微生物污染或发生人为差错；③多次继代培养有可能造成遗传性变异及材料的分化和再生能力的逐渐丧失。离体种质保存主要有低温保存和超低温保存两种方式第一节低温保存低温保存是在低于正常培养温度下保存植物组织培养物的技术，该方法常结合改变培养基成分、控制光照等措施，以减缓保存材料的生长速度，延长继代时间，故又称小生长法。该法简单易行，需要设备少，投资小，技术成熟，可以作为植物种质资源的中长期保存方法。低温保存的基本特征是保存材料的定期继代培养，不断繁殖更新

3、。保存过程中要选用遗传上稳定的外植体作为起始培养材料，以尽可能地减少遗传变异的机会。所以具有器官分化能力的体细胞胚和植物茎尖分生组织，能够保持发育的完整性，在遗传上也较稳定，适于用做低温保存的起始材料。低温保存的基本措施是控制保存材料所处的温度和光照。在一定温度范围内材料的寿命随保存温度的降低而延长，一般5～10℃适宜保存温带起源植物的试管苗，15～18℃可用于热带植物试管苗的保存。适当缩短光照时间，降低光照强度，也能减缓材料的生长速度，延长保存时间。但也要防止光照过弱使材料生长纤细，形成弱苗。导致生长不维持。改变培养基成分：生长抑制剂保存：在其中添加脱落酸（ABA，最大用

4、量一般为5-10mg/L）、矮壮素（CCC）、青鲜素、多效唑（PP333）等生长延缓剂；高渗保存：添加甘露醇、蔗糖（其质量分数由3%提高到10%，可明显抑制培养物的生长）、PEG等渗透剂。其中以对材料遗传稳定性影响小的甘露醇为最好，培养基中加入较低含量的甘露醇可以明显提高材料的存活率。饥饿保存：从培养基中减去1~2种营养元素，使植株缺乏相关营养而处于最小生长量。低温保存技术（以魔芋为例）：1、选取茎尖分生组织为外植体，建立试管苗无性系2、选取生长健壮的、芽大小为1.5cm的材料移入保存培养基，于25℃，光照度1000lx，12h条件下培养一周（培养基中添加脱落酸和甘露醇）3

5、、转入4℃黑暗中保存。4、材料每6个月继代培养一次，继代培养时，从形态、经济性状、生理生化等方面进行遗传稳定性鉴定。第二节超低温保存超低温保存也叫冷冻保存，一般以液态氮（-196℃）为冷源，使温度维持在-196℃。在如此低温下，新陈代谢活动基本停止，处于“生机停顿”（suspendedanimation）状态。在此状态下材料不可能产生遗传变异。可对材料进行长期保存。超低温保存1949年成功的应用于动物细胞的保存。20世纪70年代以来，应用于植物材料保存，目前已经有不少成功的例子。在超低温保存中茎尖和幼胚等较为合适。这些材料遗传稳定，再生能力强，解冻后易于成活和种植，对于冷冻

6、和解冻过程中所产生的胁迫忍受能力也强。保存原理：低温冰冻过程中，如果生物细胞内水分结冰，细胞结构就遭到不可逆的破坏，导致细胞核组织死亡。植物材料在超低温条件下，冰冻过程中避免了细胞内水分结冰，并且在解冻过程中防止细胞内水分次生结冰而达到植物材料保存目的。植物细胞含水量大，冰冻保存难度大，投放液氮中易引起组织和细胞死亡，故须借助于冷冻保护剂，防止细胞冰冻或解冻时引起过度脱水而遭到破坏，保护细胞。超低温保存的基本程序包括预处理、冷冻处理、冷冻贮存、解冻和再培养。一、冷冻的方法（一）快速冷冻法本法是将植物从0℃或其他预处理温度直接投入液氮。其降温速度在每分钟1000℃以上。在降温

7、冷冻过程中，从-10℃到-140℃是植物体内冰晶形成和增长的危险温度区，在此以下冰晶不再增生。因此，快速冷冻成功的关键在于利用超速冷冻，使细胞内的水迅速越过冰晶生长的危险温度区。细胞内的水形成“玻璃化”状态。采用快速冷冻方法，要求细胞体积小，细胞质浓厚，含水量低，液泡化程度低的材料。如：高度脱水的种子、花粉、球茎或块根，茎尖分生组织等。（二）慢速冷冻法本法是以每分钟0.1～10℃的降温速度（一般1～2℃/min）使材料从0℃降至-100℃左右，稳定1h，随即浸入液氮，或者以此降温速度连续降温至-196℃。在此条件下