血小板衍生膜微粒对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的影响

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1、血小板衍生膜微粒对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的影响作者：陈宝安，仲悦娇，黄成垠，李翠萍，史光耀，肖建宇，唐荣才丁家华，高冲，孙耘玉，程坚，王骏，赵刚，马燕，宋慧慧，费菲，裴孝平【摘要】本研究探讨血小板衍生膜微粒(plateletderivedmembranemicroparticles,PMP)对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）新生血管形成的影响。用凝血酶激活血小板释放出PMP，再经高速离心分离出PMP，用流式细胞仪检定PMP，并用BCA法测定PMP的含量。将PMP接种于鸡胚绒毛尿囊膜上，观察PMP对CAM血管生成的影响。结果显示：当PMP的浓度为80μg/ml时，孵育72

2、小时后混合纤维素滤膜周围可见到放射状密集生长的血管网,血管分支数为112.5±11.31，血管面积为（6.19±1.29）﹪，而在对照组无特异性密集血管生成，血管分支数为82.6±8.05，血管面积为1.78±0.33，二组比较有显著性差异（P＜0.05）；而与VEGF组比较，后者的血管分支数为128.4±10.02，血管面积为7.44±1.36，二组比较差异无显著性。结论：PMP对CAM新生血管的生成有促进作用。【关键词】血小板膜衍生微粒EffectsofPlateletderivedMembraneMicroparticlesonAngiogenesisi

3、nChickChorioallantoicMembranesAbstractThisstudyembranemicroparticles(PMPs)inchickchorioallantoicmembranes(CAM).Thrombinetry(FCM)bintoproducePMPsandBCAmethodlPMPs,thevesselsina‘spokedixedfibrousfiltermembranes,numberofvesselramificationberofvesselramificationandratioofvesselarea/CAMar

4、eaincontrolgroupentionedconditions,thenumberofvesselramificationandratioofvesselarea/CAMareainVEGFgroupotiveeffectontheformationofcapillariesinchickchorioallantoicmembranes.Keyembranemicroparticle；chickembryochorioallantoicmembrane;angiogenesis血小板衍生膜微粒（plateletderivedmembranemicropar

5、ticles,PMP）是血小板在钙离子载体、凝血酶、高切应力、胶原、细胞因子等诱导剂激活的过程中产生的直径小于1.0μm的小囊泡颗粒。这种微粒具有促凝活性,可黏附于血管内皮细胞,增强正常血小板的黏附能力［1］，并含有多种特异性膜糖蛋白和生物活性受体，是血小板活化的标志之一。最近的研究证实，血管生成因子（FGF2和VEGF）的水平和PMP水平有着很强的相关性［2］。PMP能刺激内皮细胞增殖、迁移并影响细胞形态，以促进血管生成的发生［3］。本实验将PMP与鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）共同孵育观察PMP对CAM新生血管的影响。材料和方法仪器血细胞分离机为BexterFen

6、pusck2。数码相机：日本佳能公司产品，型号：IZOOM。二氧化碳培养箱为日本Hirasa混合纤维素滤膜购自Drummond公司。血小板悬液由江苏省血液中心成份科提供，均为血细胞分离机采集的健康供血者的新鲜血小板，浓度为（900-1200）×109/L。将血小板悬液于22±2℃经2500rpm离心10分钟，沉淀物悬浮于缓冲液中(Na2EDTA：9mmol/L,Na2HPO4：26.4mmol/L,NaCl:140mmol/L),并用缓冲液洗涤2次。最后将洗涤的血小板悬浮于Tyrode缓冲液中(NaCl：137mmol/L,NaCHO3：12mmol/L,葡萄

7、糖：5.5mmol/L,KCl：2mmol/L，MgCl:1mmol/L,NaHPO4：0.3mmol/L)。调整血小板浓度为8×108/ml。采用1.0U/ml的凝血酶激活血小板（放37℃恒温摇床上振荡30分钟）。激活后的血小板于4℃，4000rpm离心20分钟,上清分离于另一试管中，于4℃，17000rpm，离心1小时，并洗涤1次，沉淀物悬浮于Tyrode缓冲液中［4，5］，整个操作在无菌条件下进行。血小板衍生膜微粒的定量等量1％多聚甲醛固定PMP后用CD61标记PMP，选择直径1μm的微粒确定PMP的直径阈值，同时设定同型对照。用流式细胞仪分析高速离心前后P

8、MP的纯度