傅立叶变换离子回旋共振质谱分析与鉴定骨桥蛋白的多肽片段论文

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1、傅立叶变换离子回旋共振质谱分析与鉴定骨桥蛋白的多肽片段论文蒋鑫萍程舸于雷王韶刘晓梅石磊【摘要】采用高效液相色谱(HPLC)SCX及C4色谱柱从人乳样品的乳清部分分离与纯化出骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)，在一定条件下将其用胰蛋白酶酶解后，利用高分辨傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICRMS)，结合微喷雾(Nanospray)技术，并借助Mascot软件数据库，获得了OPN相关多肽片段GDSVVYGLR和QNLLAPQTLPSK的质谱结构信息，分析了其裂解机理。研究表明，利用FT

2、ICRMS并结合HPLC等化学方法.freelatoidarthritis,RA)的病灶中会出现OPN的过度表达，它可能通过调节病灶部位细胞因子的分泌来调控RA病理过程中的炎症反应11,12，并且由于病因不同以及与药物的作用将导致OPN细微结构的复杂化，即会出现不同位点磷酸化或糖基化修饰的OPN多肽片段。因此，从OPN中典型的多肽片段入手，寻找RA中促炎症作用调控网络起关键作用的炎症因子靶点，对于深入认识RA的发病机理和研发新的RA药物具有重要的指导作用。傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTI

3、CRMS)以高分辨率、高质量检测上限、高扫描速度、宽的动态范围和高质量准确度等技术优势13～15，越来越广泛地应用到生命科学，特别是在生物大分子的研究中。同时，以基质辅助激光解吸离子化技术和电喷雾离子化技术为代表的新型离子化方法也给FTICRMS拓展了更广泛的应用空间。迄今为止，蛋白质组学研究策略主要包括“BottomUp”和“TopDoUp”是在多肽水平上鉴定和研究蛋白质，对蛋白质纯度要求不需象二维电泳纯化的蛋白那么高，即可将蛋白质酶解成多肽后再进行分析，覆盖率可达100%，不仅增强了鉴

4、定的可信度，也能更好地鉴定蛋白质翻译后的修饰位点17,18。本研究采用“BottomUp”并结合HPLC和配有Nanospray技术的高分辨FTICRMS等化学方法，快速分离并纯化了人乳中的OPN，借助Mascot软件数据库进行质谱分析，准确鉴定了OPN中有代表性的多肽片段GDSVVYGLR和QNLLAPQTLPSK的质谱裂解机理。2实验部分2.1仪器与试剂7.0T傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(FTICRMS，Thermo公司);超高速离心机(美国AlfaS，测定样品的质谱图。流动相A

5、为0.5%乙酸99.5%水，B为90%乙腈9.5%水0.5%乙酸，流速为500nL/min，梯度洗脱。FTICRMS金属毛细管电压：2500V℃毛细管温度：110℃;锥孔电压：-30V，碰撞激发电压：2.7～3.2V;碰撞气体为高纯氮气，脉冲时间：250ms。3结果与讨论3.1骨桥蛋白的分离3.1.1人乳样品的分离人乳样品收集自哺乳期为8个月的健康者，样品从-20℃冰箱中取出，室温放置2h后，量取适量样品于Eppendorf管中，以14000r/min离心45min，温度控制在不超过0

6、℃。离心处理后，参看分离与纯化人乳的流程(图解1)，将人乳样品进行初步的分离，得到乳脂部分、乳清部分、乳粒部分。OPN在中层的乳清部分中，除去酪蛋白后的乳清蛋白后，采用高效液相色谱配有SCX柱进行初步分离得到8个组分。图解1分离与纯化人乳的流程Scheme1Separationandpurificationschemeofhumanmilk3.1.2乳清部分的纯化首先将跟踪、鉴定出OPN的SCX5和SCX6组分合并，然后继续用C4色谱柱对SCX5和SCX6组分进行纯化，最终得到乳清部分的蛋白OP

7、N。具体实验结果参看人乳乳清部分的纯化流程(图解2)，得到纯度较高的骨桥蛋白OPN。3.2骨桥蛋白中多肽片段的鉴定将纯化后样品OPN利用胰蛋白酶在温和条件下进行酶解，利用FTICRMS串联质谱(MS/MS或MSn)，母离子的活化采取碰撞激发解离(CAD)和电子捕获诱导解离(ECD)的方式，根据多肽碎片命名规则以及CAD的肽键断裂和ECD的NCα断裂在裂解机理上的互补性规律(图解3)，借助Mascot软件数据库进行质谱分析，分别鉴定了OPN蛋白中有代表性的双电荷分子离子峰为m/z483.25

8、70的多肽片段和双电荷分子离子峰为m/z655.3816的多肽片段。在双电荷分子离子峰为483.2570多肽片段的CAD谱图(图1a)中，主要得到b与y离子的信息，b+4：m/z359.1561，b+5：m/z458.2245，b+6：m/z621.2882，b+7：m/z678.3093，y+2：m/z288.2031，y+3：m/z345.2245，y+4：m/z508.2878，y+5：m/z607.3561，y+6：m/z706.4238，y+7：m/z793.4566，初步证明所含的多