论生命科学与技术学院(2012年)

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1、论生命科学与技术学院(2012年)论生命科学与技术学院(2012年)_生科院毕业论文写作编辑模导读：木分别放入已灭菌的富集培养基中，于28℃温箱中富集培养2～3d。1.4.2平板分离对培养后变混浊的富集培养液按照梯度稀释法用无菌水稀释到10-5，在超净工作台中的无菌条件下，准确吸取100μL的10-3～10-5不同稀释倍数的菌液涂布于已灭菌的平板培养基上，于28℃温箱中倒置培养2～3d。1.4.3纯化菌种根据菌落形态特征的比对及分子鉴定166株菌株在摇床180r/min、28℃的条件下发酵培养48hM3。提取菌株M3的基因组进行26S

2、rDNAPCR：×××指导老师：×××初步鉴定菌株M3属于0引言。[2]该酶具有广泛的应用前景，研究，已有不少研究者对黑曲霉、木霉(Trichodermasp.)等真菌及短小芽孢杆菌(、环状芽孢杆菌(B.circulans)等细菌的木聚糖酶进行了研究。糖，从中很容易筛选得到高效降解木聚糖的菌株。本研究主要从宝天曼森离菌株的第1页（共7页）步鉴定出分离菌株在系统发育上的分类地位。样品试剂溴钾酚绿、1%刚果红溶液、溶液、柠檬酸缓冲液、DNS试剂、试剂酵母基因组提取试剂盒、PCRMagicMix2.0、NL1、引物NL4、TAE缓冲液、琼脂

3、糖凝胶、EB试剂。培养基[3]木聚糖1%、酵母氮基础培养基1%、氯霉素(80μL/100mL)；0.5%2%、80μL/100mL）；0.3%、麦芽粉0.3%、蛋白胨0.5%、琼脂2%、氯霉μL/100mL）；1.4菌株筛选[4,5]1.4.11%、（80取7支干净小试管，向每支试管中分装入3～5mL富集培养基，于121℃高压灭菌锅中灭菌20min。用镊子夹取少许实验室保存的7种森林腐木分别放入已灭菌的富集培养基中，于28℃温箱中富集培养2～3d。1.4.2平板分离对培养后变混浊的富集培养液按照梯度稀释法用无菌水稀释到10-5，在超净

4、工作台中的无菌条件下，准确吸取100μL的10-3～10-5不同稀释倍数的菌液涂布于已灭菌的平板培养基上，于28℃温箱中倒置培养2～3d。1.4.3纯化菌种根据菌落形态特征的比对，找出不同形态的菌株。在无菌条件下，挑取不同形态的单菌落在已灭菌的纯化培养基上进行扇形划线，于28℃温箱中倒置培养2～3d。按照同样的方法划线2～3次后即可得到纯菌落。用镊子夹取已灭菌的牙签，将纯化培养基中的纯菌落点蘸到鉴别培养基上，于28℃温箱中倒置培养2～3d。待菌落长大后用1%刚果红进行活性染色30min，倾去染液，再用1mol/LNaCl溶液漂洗1h，

5、观察菌落周围是否有透明圈出现以及透明圈的大小。出现透明圈的菌落即为所需要的木聚糖降解菌，再选出透明圈大且明显的菌株接种到斜面培养基上于4℃冰箱中保存备用。1.5木聚糖酶活力的测定1.5.1木糖标准曲线的制备取烘干好的木糖0.1000g100mL，得到1mg/mL表1制备木糖标准曲线的溶液体系（单位：mL）编号木糖标准液蒸馏水DNS002.01.510.21.81.520.41.61.530.61.41.540.81.21.551.01.01.561.20.81.57支带刻度的平底试管，编号为1～7，分别加入上述溶液。于沸水浴5min后

6、，立即放入冷水中冷却，加蒸馏水定容至25mL，用TU-1901540nm波长下测OD值并制作工作曲线备用。摇瓶培养取一环旺盛生长于斜面培养基上的菌种接种到已灭菌的种子培养基中，28℃、180r/min进行三角瓶摇床培养24h，取2mL菌液加入已灭菌的发酵培养基中28℃，180r/min摇床培养48h。1.5.3木聚糖酶粗酶液的制备取5mL发酵培养基菌液于已灭菌的10mL离心管中，在4℃离心机中6000rpm离心20min，转移上清至另一离心管，则为所需的粗酶液。取各酶液1mL装入1.5mL离心管中沸水浴煮沸10min得到失活酶液作为空

7、白对照。1.5.4木聚糖酶酶活力的测定[6]取25mL具盖带刻度的平底试管，加入1.5mL1%木聚糖柠檬酸缓冲液于50℃水浴预热15min，再加入0.5mL相应酶液(对照中加入0.5mL灭活酶液)，50℃水浴保温30min(隔几分钟震荡数次)。然后加入1.5mL的DNS试剂，沸水浴煮沸5min，立即放入冷水中冷却，并定容至25mL。???。1.6.1基因组DNA的提取菌株基因组DNA用接种环从1.6菌株的分子鉴定μL无菌水中，组提取试剂盒中使用说明书上的流程进行各菌株基因组的提取，并将其保12000rpm离心1min存于TE缓冲液中，

8、放入4℃冰箱中保存备用。将各菌株基因组进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据条带的亮度确定基因组的稀释倍数，作为PCR扩增的模板。???2结果与分析2.1菌株筛选用木聚糖作为唯一碳源从实验室保存的腐木中分离能产木聚糖酶的菌种。??