转基因家畜的新品系培育

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1、转基因家畜的新品系培育转基因家畜的新品系培育　摘要：分析了利用现有的转基因技术所获得的Ｇ０代转基因家畜外源基因的整合和表达状况：在随机整合的情况下，存在大量嵌合体现象，不同的整合位点其表达效应不同；应用基因打靶技术实现定位整合，情况相对简单。在此基础上，提出不同整合类型对Ｇ０代转基因家畜进行遴选的方法和程序，以及建立转基因家畜纯合体的两条技术路线：一是利用遴选出的具有遗传稳定性的Ｇ０代个体，通过常规繁育获得；二是利用基因打靶技术，获得双等位基因整合（或敲除）的家畜。最后根据家畜育种的理论，提出了建立转基因新品系、进而形成新品种的步骤。　　

2、关键词：转基因家畜；纯合体；新品系　　中图分类号：Ｓ８１３.3有效整合的位点具有遗传的稳定性。樊俊华等［７］对来自同一Ｇ０代亲本的Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３代转PＧＨ基因猪，采用非同位素标记的染色体原位杂交技术进行了定位检测，结果表明，外源基因均定位于１３ｑ１２上。表明能够传代的Ｇ０代转基因动物，其后代的整合位点是相对稳定的。　　１．１．３外源基因的整合形式外源基因随机整合的形式有三种：单拷贝单一位点整合，多拷贝串联单一位点整合，多拷贝多位点整合。多拷贝整合，外源ＤＮＡ通常呈现多串状整合；在绝大多数情况下，某一位点上多拷贝串状整合的外源基因，采取头

3、尾相连的排列方式；这些方向一致的串状拷贝，是被导入ＤＮＡ的完整或近乎完整的拷贝，少数情况下也有在两个相邻拷贝结合的地方出现小的不完整；在稀有的情况下，发现两个拷贝呈现头对头或尾对尾的连接方式，在这种情况下常发生末端缺失［１］。转基因的另一种变化是某些碱基被甲基化。转基因拷贝的不完整、末端缺失或甲基化，都会影响基因表达和遗传的稳定性。多拷贝串联的拷贝数可从几个到１００个以上。Ｈａｍｍｅｒ等［８］以定量斑点杂交法，检测转基因猪整合外源基因的拷贝数，发现整合ＭＴ－ｈＧＨ基因拷贝数在１～４９０个，整合ＭＴ－ｂＨＧ基因拷贝数在１～２８个，整合ＭＴ－

4、ｈＧＲＦ基因拷贝数在３０～１００个。孔庆然等［９］采用定量ＰＣＲ技术，检测了两头体细胞核移植技术生产的绿色荧光蛋白转基因猪，其外源基因拷贝数分别为（３０．８５±１．７７）个和（１８．８７±１．３４）个。　　已有的转基因动物研究，尚未见转基因拷贝数与表达水平之间具有很明确相关性的报道。但这是需要进一步深入研究的问题。　　１．２定位整合　　外源基因的定位整合一般是通过基因打靶实现的，基因打靶是精确地人工修饰基因组的一种技术。这种技术的特征在于：第一，具有直接性，直接作用于靶基因，不涉及基因组的其他位置；第二，具有准

5、确性，可以将设计好的ＤＮＡ序列插入选定的目标基因座，或者用设计好的ＤＮＡ序列去取代基因座中相应的ＤＮＡ序列。因此，通过基因打靶技术制备的转基因动物，应不存在转基因的嵌合体现象，其整合位点和拷贝数也应是确定的。　　对于家畜而言，实现外源基因的定位整合（或基因敲除），必须通过核移植的程序。目前体细胞核移植生产克隆家畜的效率很低，大量的重构胚在孕育期死亡，出生后的个体生长发育不正常、甚至死亡的频率也很高。这些情况，应主要是由于克隆技术不完善而导致的；但也不能排除一部分是由于外源基因（或敲除基因）的表达或整合位点的不当所致。　　２Ｇ０代转基因家畜

6、的遴选　　了解了外源基因在Ｇ０代转基因家畜中的整合和表达状况，就不难理解要进行定向育种，就必须对Ｇ０代转基因个体进行遴选。　　２．１遴选的内容和目标　　Ｇ０代转基因家畜是建立新品系的原始材料，遴选正确与否，将决定今后育种工作能否进行下去。选择内容应包括如下几点：①Ｇ０代转基因家畜的生长发育、繁殖性能是否正常；②外源基因的表达是否达到预期；③外源基因整合和表达水平是否具有遗传稳定性。　　最终的遴选目标应是：生长发育和繁殖性能正常，外源基因的表达水平达到预期，且具有遗传稳定性的个体。　　２．２遴选程序　　２．２．１Ｇ０代生长发育、繁殖性能和生

7、理生化指标的测定和评价对所有Ｇ０代个体按家畜育种的常规进行饲养管理（有些种类的转基因家畜也许需要特殊的饲养管理）并观测其生长发育和繁殖性能，在规定的日龄进行生理生化指标的检测，重点观察有无异常或其他的病理表现。所有测定和检测，均应以同窝非转基因家畜或亲本品种的成绩作为对照。　　２．２．２Ｇ０代转基因家畜的表达检测对生长发育、繁殖性能和生理生化指标正常的Ｇ０代转基因家畜，进行转基因的表达检测。表达检测的程序，应首先进行转录（ｍＲＮＡ）水平的检测，然后进行翻译水平（蛋白质水平）的定性和定量检测，有些还要进行生物活性的检测、功能测试和性能测定。

8、从而选择出达到预期表达水平的Ｇ０代转基因个体。　　２．２．３Ｇ０代个体遗传稳定性测定测定Ｇ０代转基因个体的遗传稳定性，需进行繁殖传代，从后代的检测情况进行判断。　　对于随机整合的转基因个体，繁