westernblotting技术实验室专用

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1、Westernblotting1.总蛋白的提取a)收集小鼠组织或是细胞入1.5ml离心管中。b)每管加一定量的蛋白裂解液。注：蛋白裂解液的多少以最后能得到的蛋白浓度达到10g/l左右为佳。c)用匀浆棒进行匀浆（冰中进行）。d)加入一定量的PMSF，使其终浓度为1mM。e)冰中放置30~60min。f)4℃、12000rpm离心30min，上清即为总蛋白。可放-30℃保存待用。2.蛋白浓度的测定（BCA试剂盒）A.标准曲线的制作a)配不同浓度的标准液（见表2-1）表2-1BSA各浓度标准液的配制Table2.1

2、PreparationofstandardsolutionwithdifferentBSAconcentration10mMTris-HCl（pH=7.5）FinalBSAConcentrationA700μl100μlBSA250μg/μlB400μl400μlA液125μg/μlC450μl300μlB液50μg/μlD400μl400μlC液25μg/μlE400μl100μlD液5μg/μlF400μl0μg/μlb)按50：1配SolutionA：SolutionB混合液，每个样本需2ml。c)在每

3、个试管中加入2mlSolutionA：SolutionB混合液以及0.1ml样本，于60℃水浴30min。d)测OD562nm，空白对照为10mMTris-HCl（pH=7.5），绘制标准曲线。B.测样品浓度a)用10mMTris-HCl（pH=7.5）稀释样品100倍。b)加2mlSolutionA：SolutionB混合液+0.1ml稀释样本，60℃水浴30min。c)测OD562nm。调出标准曲线，读出对应浓度值，再乘以100，即为该样品浓度。2.SDS-PAGE电泳A.PAGE胶的制备（5%浓缩胶、1

4、0%分离胶）。a)10%分离胶溶液的配制30%Acr-Bis（29：1）1.32ml1.5MTris-HCl(pH=8.8)1ml20%SDS20μl加水至4ml，轻轻混匀，避免气泡产生。倒胶前加入20μl的10%过硫酸铵（APS）以及2μl的TEMED，轻轻混匀，缓慢注入两玻璃板之间（液面最高处应在梳子下方约0.5cm处）。然后缓慢加入1ml去离子水，37℃放置30min。待胶凝固，吸干胶上面的水。b)5%浓缩胶溶液的配制30%Acr-Bis（29：1）0.34ml0.5MTris-HCl(pH=6.8)0

5、.5ml20%SDS10μl加水至2ml，轻轻混匀，避免气泡产生。倒胶前加入10μl的10%APS以及2μl的TEMED，轻轻混匀，缓慢注入两玻璃板之间分离胶的上方，加满，插入梳子。室温放置待其凝固。B.蛋白样本制备取20~100μg的总蛋白，加入同样体积的2×蛋白上样缓冲液，于沸水中煮5min，然后6000rmp、2min，取上清待用。C.电泳a)把做好的浓缩-分离胶板放入电泳装置中，加入1×蛋白电泳缓冲液，轻轻拔出梳子。b)把蛋白样本加入加样孔。a)电泳：浓缩胶70V，分离胶140V，直至溴酚蓝迁移至底部

6、，停止电泳。B.电转膜a)准备好与胶大小一致的硝酸纤维素膜一张、两张相应大小的滤纸，将其与纤维垫放入1×蛋白转膜缓冲液中浸泡15~60min。b)按照纤维垫、滤纸、胶、膜、滤纸、纤维垫的顺序作好转膜三明治，滤纸、胶、膜、滤纸各层中要用玻棒赶尽气泡，然后放入转膜装置中。注意放置的次序：负极（黑孔板）—→纤维垫—→滤纸—→胶—→膜—→滤纸—→纤维垫—→正极（红孔板）。c)于4℃、100V转膜1~2h。d)转膜完毕后，取出膜，放入丽春红染液中染色5min，观察转膜效果。e)将膜于清水中冲洗，洗去丽春红，放入PBS，

7、待用。C.封闭将膜放入5%脱脂奶粉（PBS配制）中，于脱色摇床中室温缓慢摇1h。D.杂交a)用PBS或是封闭液稀释一抗：Rabbit-anti-Dnaic2（1：2）、Rabbit-anti-DNAI2（1：1000）、Mouse-anti-myc（1：1000）、Mouse-anti-β-tublin（1：1000）、Mouse-anti-Stat3（1：100）、Rabbit-anti-p-Stat3（1：100）或是Mouse-anti-PCNA（1：100），于37℃摇2~3h或是4℃摇过夜。b)用含

8、1%Tween-20的PBS洗膜两次，每次5min。c)加入用PBS或是封闭液稀释的相应的二抗：HRP-Goat-anti-MouseIgG（1：1000）、HRP-Goat-anti-MouseIgG（1：2000），于37℃摇1h。E.ECL显色（ECL显色试剂盒）a)A液：B液=1：1混合，加到膜上，封好。b)压片曝光1~5min。2.显影、定影，用水冲洗胶片、晾干。蛋白裂解贮存液：1MTri