湖北省规模化养鸭主要疫病流行情况调查

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1、湖北省规模化养鸭主要疫病流行情况调查湖北省规模化养鸭主要疫病流行情况调查　摘要：对２００６～２００９年湖北省规模化养鸭主要疫病的流行情况进行实地调查和实验室诊断。共调查７个地（市）７９个养鸭户和养鸭场１８２８５０只鸭的主要疾病流行情况。成年鸭主要疾病有禽流感、鸭瘟、副粘病毒病、巴氏杆菌病、大肠杆菌和沙门氏菌混合感染等，调查３６群成年鸭共８３２００只，其中发病２６８９０只，发病率３２．３％；死亡６７３７只，病死率２５．１％；对产蛋鸭生产性能均有不同程度影响。雏鸭的主要疾病有鸭病毒性肝炎、鸭疫里默氏杆菌病、大肠杆菌病和沙门氏菌病等，调查４３群雏鸭共９９６５０只，其中发病１９７２０只，

2、发病率１９．８％；死亡５５４１只，病死率２８．１％。从采集的病料中分别分离到７株禽流感病毒、３株副粘病毒和３株鸭肝炎病毒；分离到１７株鸭疫里默氏杆菌、３６株大肠杆菌、９株巴氏杆菌等病原菌。　　关键词：鸭；流行病学调查；病原分离鉴定；湖北省　　中图分类号：Ｓ８５８．３２　　１．２．２用于检测鸭瘟病毒病料的ＤＮＡ提取将病料进行充分研磨（病料1g加4mLＰＢＳ），反复冻融３次，４℃１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液５００μＬ，加入蛋白酶Ｋ至终浓度为５００μｇ／ｍＬ，ＳＤＳ至终浓度为１％，充分混匀后，置５５℃水浴作用３０ｍｉｎ。然后用Ｔｉｒｓ饱和酚抽提１次，吸取水相

3、，加１／１０体积３ｍｏｌ／ＬＮａＡｃ及２．５倍体积无水乙醇沉淀，离心弃上清。沉淀用７５％乙醇洗涤，自然凉干后溶解于一定量的灭菌去离子水中，作为ＰＣＲ扩增模板。　　１．２．３鸭瘟病毒ＰＣＲ反应体系组成为：１０ＰＣＲBｕｆｆｅｒ５μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）４μＬ，ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）３μＬ，ＰＣＲ上、下游引物各１μＬ，模板ＤＮＡ２μＬ，ｒＴａｑ酶（５Ｕ／μＬ）０．５μＬ，加灭菌超纯水至５０μＬ。反应条件为：９５℃预变性１０ｍｉｎ；按９４℃变性１ｍｉｎ，５４℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１．５ｍｉｎ，共进行３３个循环；最

4、后７２℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物用２％琼脂糖凝胶进行电泳，紫外灯下观察其扩增片段大小。以出现特异且大小相符条带的样品为阳性。　　１．２．４用于检测禽流感病毒、禽副粘病毒、鸭病毒性肝炎病毒病料的ＲＮＡ提取取步骤１．２．２制备的２００μＬ组织病料悬浮液上清，加入８００μＬＴｒｉｚｏｌＲＮＡ裂解液混匀，室温放置１０ｍｉｎ；加入２００μＬ氯仿，混匀，４℃１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，吸取水相，加入等体积的异丙醇，冰浴放置１０ｍｉｎ后，４℃１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ；沉淀用７５％乙醇洗涤，在超净台中通风晾干；ＲＮＡ沉淀溶解于２０μＬ用ＤＥＰＣ处理过的

5、灭菌去离子水中，作为ＲＴ－ＰＣＲ检测模板。　　１．２．５ＲＴ－ＰＣＲ检测禽流感、副粘病毒、鸭病毒性肝炎病毒的扩增条件基本一致。ＲＴ反应总体积为２５μＬ，组成如下：５ＲＴBｕｆｆｅｒ５μＬ，ｄＮＴＰｓ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，ＲＮａｓｉｎ（４０Ｕ／μＬ）１μＬ，ＲＴ引物１μＬ，ＲＮＡ模板１３μＬ，混匀离心。６５℃作用１５ｍｉｎ，待稍微冷却后，加入Ｍ－ＭＬＶ（２００Ｕ／μＬ）１μＬ，４２℃１ｈ；９５℃作用５ｍｉｎ，冷却后即可进行ＰＣＲ。　　ＰＣＲ反应总体积为５０μＬ，包括：１０Ｐ

6、ＣＲBｕｆｆｅｒ5μＬ，ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）１．４μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）４μＬ，两条ＰＣＲ引物各１μＬ，ＲＴ产物２μＬ，ｒＴａｑ酶（５Ｕ／μＬ）０．５μＬ，加去离子水至５０μＬ，混合均匀。将混合物９５℃变性５ｍｉｎ后进入ＰＣＲ循环。参数设置为９４℃１ｍｉｎ，５１℃１ｍｉｎ，７２℃１ｍｉｎ。30个循环。待ＰＣＲ结束，取ＰＣＲ产物进行１．５％琼脂糖凝胶电泳，观察扩增片段大小。以ＰＣＲ产物中出现目的条带的样品为阳性。　　１．２．６病毒分离鉴定经ＰＣＲ测定禽流感病毒（ＡＩＶ）为阳性的病料，用含双抗的Ｈａｎｋｓ液洗涤

7、３次，磨碎（1g病料加8mLＨａｎｋｓ液）乳剂，然后反复冻融３次，３０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，取上清液杂检无菌后保存于－１０℃备用，按殷震等［８］介绍的方法，分别接种ＳＰＦ鸡胚、鸭胚或细胞，对分离物按照鸭瘟病毒、禽流感病毒、禽副粘病毒、鸭病毒性肝炎病毒的鉴定方法分别进行鉴定。　　１．３细菌病的检测　　无菌取发病鸭的肝脏、心脏等组织，划线接种于普通琼脂平板和ＳＴＡ平板，分别置二氧化碳培养箱和普通培养箱３７℃培养１８～２４ｈ，观察菌落生长情况。将生长的菌落接种于麦康凯（Ｍ．Ｃ）