中国两栖类病原壶菌检测与有害生物风险分析

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1、中国两栖类病原壶菌检测与有害生物风险分析1绪论1.1课题背景本研究在《国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006-2020年）》指导下，立足公共安全重点领域及食品安全与出入境检验检疫优先主题，开展两栖类病原壶菌出入境检验检疫风险评估，对风险因素追踪溯源、制定安全标准与有效监测检测等关键技术，最终实现维护我国进出境利益，增强应对国际贸易壁全能力。国际贸易是经济成长的发动机，是许多国家的经济命脉，通过国际贸易，世界上所有国家在经济上都相互影响，甚至成为国际政治斗争的重要内容，各国都力图通过对外贸易，扩大相互作用，改善自身国际环境，为本国的经济

2、发展创造良好的外部条件。全球两栖类国际贸易呈现不断增长，两栖类养殖产业价值3亿美元，涉及全球上百个国家和地区。我国牛蛙年销售额约为4亿元，涉及北京、天津等17个省（市、区）；海南、广东、广西的虎纹蛙养殖已成为农民增收致富的主要产业。两栖类出口贸易己经和我国国民经济的发展以及和谐社会的构建密不可分了，因此确保我国国内生态、养殖安全是保证顺利出口的关键。面对国际社会的怀疑，我们更应该对两栖类壶菌追踪溯源，排除国外错误导向。技术性贸易壁全(TBT)是影响21世纪我国出口贸易的重要因素。关税与贸易总协定(GATT)及世贸组织(P检测方法的建立2.

3、1材料和方法2.1.1质粒和菌株及主要试剂阳性壶菌样本由本美国Joyce提供。组织/细胞/血液基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；Marker(DL2000)购自大连TaKaRa公司；所用菌株DH5a，质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒，dATP，dTTP，dCTP，dGTP均购买自大连宝生物公司。BstDNA聚合酶，琼脂糖，甜菜碱，镁离子购自购自NEB公司；其他常规试剂均为国产分析纯。2.1.2实验用主要仪器电子天平购自瑞士precisa公司；HS800D三孔恒温水浴锅购自上海康华生化仪器制造厂；旋祸混合器购自北京金北德工

4、贸有限公司；高速离心机和高速冷冻离心机均购自德国Kandro公司；PCR仪为美国ThermalCycler公司的MJPTC200型；制冰机购自日本SANYO公司；微波炉购自海尔集团；DYY-6C型琼脂糖水平电泳仪购自北京市六一仪器厂；紫外凝胶成像系统购自香港Gene公司；湿热灭菌器购自日本SANYO公司；电热恒温鼓风干燥箱购自上海齐欣科学仪器有限公司；冰箱购自三星公司。..2.2实验结果以壶菌保守的IST1与IST2序列（GenBank:AY598034)为基础。利用01igo7.0和Primer5.0软件设计特异性的引物序列（BdlA和

5、Bd2A)，PCR产物为300bp，引物序列如下：BdlA,5'-CAGTGTGCCATATGTCACG-3'；Bd2A,5-CATGGTTCATATCTGTCCAG-3；壶菌LAMP引物设计根据其基础上使用PrimerExpIorerV3软件设计2套引物。(见图2-1)壶菌LAMP弓I物在62°C下扩增不同时间后的核酸电泳检测结果（见图2-6)。其中扩增30min、45min、60min后均有扩增条带产生，对照组无条带产生，此图可看出本研究所设计的壶菌LAMP引物在62°C下扩增时间可在30min之后扩增

6、出特异性条带。因此可选择LAMP反应的扩增时间为30min。.3国内两栖类壶菌病生态危害识别........213.1两栖类壶菌病调查方法........213.2两栖类壶菌病调查........233.3壶菌的病理学诊断方法........253.4两栖类壶菌病LAMP方法的检测........273.5荧光定量PCR检测........283.6本章小结........324全球壶菌风险分布分析........334.1两栖类壶菌输入风险地分析........334.2小结........334.3结论和讨论........415我国

7、面临的壶菌风险分析........435.1前言........435.2欧洲国家输出风险分析........445.3美洲国家（美国）输出风险分析........535.4大洋洲国家（澳大利亚）输出风险分析........575.5非洲国家输出风险分析........595.6亚洲国家输出风险分析........635.7拉丁美洲及南美洲国家输出风险分析........685.8结果........745.9本章小结........896壶菌风险管理对策6.1风险管理总的原则风险管理措施应根据《中华人民共和国进出境动植物检疫法》和风险评

8、估结果确定，其基本原则是：中国禁止动物疫情流行国家的动物及其产品进境；输出国应未发生中国法定的进境动物一类传染病，或经风险评估，风险级别在中风险以下；如果进境动物一类传染病的评估结果为中风险及