四甲基偶氮唑盐比色法测定vero毒素

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1、四甲基偶氮唑盐比色法测定Vero毒素【摘要】目的测定Vero毒素-1对Vero细胞的毒性。方法用四甲基偶氮唑盐比色法测定Vero毒素-1对Vero细胞的毒性。结果Vero毒素-1的CD５０为1pg。结论四甲基偶氮唑盐比色法方法简便，灵敏度高，且没有同位素的污染，是测定Vero毒素-1对Vero细胞毒性的一个简便方法。【关键词】Vero毒素-1；四甲基偶氮唑盐；CD５０AnMTTcolorimetricassayformeasurementoftheCD５０toverocellsofVerotoxin-1【Abstract】Objecti

2、veTodeterminetheCD５０toVerocellsofVerotoxin-1.MethodsMTTcolorimetricassayetricassayisasuitablemethodforthedeterminationoftheCD５０toVerocellsofVerotoxin-1.【Keyann介绍了用四甲基偶氮唑盐比色法测定细胞毒性，由于其操作简便，不使用同位素等优点，现已逐步用于许多研究工作中［８，９］。本实验室应用四甲基偶氮唑盐比色法测定了Vero毒素-1的CD５０，为检测Vero毒素-1的毒性提供了一种新的

3、方法。1材料与方法1.1细胞及培养实验所用细胞为vero细胞(非洲绿猴肾细胞)。细胞在MEM培养液(含10%小牛血清2mmol/L谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)于5%CO2的培养箱中37℃培养。1.2四甲基偶氮唑盐溶液四甲基偶氮唑盐3-(4，5-Diyl-2thiazolyi)-2，5-diphenyl-2H-tetrazolooumbromid溶于pH7.2的PBS缓冲液中，浓度为50mg/ml，除菌后于4℃避光保存，使用前用含0.5%小牛血清的MEM培养液稀释至5mg/ml。1.3Vero毒素-1由本实验室

4、自制。1.4细胞死亡率的测定Vero细胞培养于96孔细胞培养板中(10４个/孔)，在5%CO2，37℃条件下培养24h后，每孔加入用Eagle’sMeM(5%小牛血清)10倍系列稀释的毒素100μl，培养72h后，吸除药液，每孔加入新鲜配制的四甲基偶氮唑盐溶液(99%MeM，0.5%小牛血清，0.5%四甲基偶氮唑盐溶液)37℃温育2h，吸取上清液，每孔加入150μl二甲基亚枫，振荡30min，在酶标仪上测定OD５７０，以不加细胞和培养基，只加四甲基偶氮唑盐溶液和二甲基亚枫的孔为空白孔，以有细胞而不加毒素的孔为对照孔，计算细胞死亡率。细胞

5、死亡率按下式计算：1.5CD５０的测定CD５０的测定方法同细胞死亡率的测定，将纯化的毒素连续倍比稀释后，测定每个浓度的死亡率，以引起50%细胞死亡的最小毒素蛋白质含量为CD５０。2结果在细胞培养孔中加入毒素后24h就可以观察到细胞的病变，用倒置显微镜观察，开始时有部分细胞圆缩，然后可见整片的细胞呈网状，继而细胞发生崩解。用连续稀释毒素，四甲基偶氮唑盐比色法测得CD５０为1pg。3讨论活细胞在生长和增殖过程中，线粒体内的脱氢酶可以将黄色的四甲基偶氮唑盐分解成蓝紫色的Fonnazan，生成的Fonnazan量的多少与细胞的数量和细胞的活性成

6、正比。但是，Fonnazan不溶于水，溶于有机剂［１０，１１］。本实验室在细胞加入四甲基偶氮唑盐，经培养产生Fonnazan后采用二甲基亚枫裂解细胞，并将沉淀在细胞内的不溶性Fonnazan溶解，然后才能测定其OD值。本实验根据活细胞的这一特征，建立了测定vero毒素-1CD５０的四甲基偶氮唑盐法，该方法与传统的３Ｈ-Tdr掺入法相比有许多的优点，如方法简便、避免使用同位素以及结果容易读取等；与肉眼目测法相比，该方法重复性好，不受实验者工作经验等主观因素的影响。本方法同样适用于其他毒素细胞毒性的测定，值得推广。【参考