血府逐瘀胶囊对单侧输尿管梗阻大鼠smad信号通路分子的影响

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1、血府逐瘀胶囊对单侧输尿管梗阻大鼠Smad信号通路分子的影响作者：陆敏周娟陆海英王飞刘煜敏张悦【摘要】目的探讨血府逐瘀胶囊对单侧输尿管梗阻(unilateralureteralobstruction,UUO)所致大鼠肾间质纤维化的作用及机理。方法雄性SD大鼠34只随机分为4组：正常组（6只）、假手术组（6只）、模型组（11只）、血府逐瘀胶囊治疗组（11只），采用UUO法建立大鼠肾间质纤维化模型，造模次日予以血府逐瘀胶囊灌胃治疗，3周后检测血清肌酐和尿素氮含量，观察肾功能变化；取肾组织进行HE和六胺银染色(periodi

2、cacid-silvermetheramine,PASM)，观察肾组织病理变化；采用213切片机以及LEIcaEG119自动包埋机（德国莱卡公司）。2方法2.1单侧输尿管梗阻动物模型的建立大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠(2ml/kg)麻醉，呈左侧卧位固定于手术板上，常规消毒，打开腹腔、腹膜，暴露并分离左侧输尿管，4～0缝合线在左输尿管上1/3处两次结扎，止血，抗感染，3～0缝合线连续缝合关闭腹腔，间断缝合皮肤。假手术组不结扎输尿管，其余操作过程均相同。正常组不做任何处理。2.2分组与给药大鼠被随机分为正常组(n=6)、假

3、手术组(n=6)、模型组(n=11)以及血府逐瘀胶囊治疗组(n=11)。治疗组于术后第2天以2.4g/（kg·d）血府逐瘀药液灌胃，假手术组及模型组均以等量生理盐水灌胃，正常组正常饲养。实验期间动物自由进食饮水。治疗21d后杀检，取材备用。2.3血清肾功能测定分别采用苦味酸法和二乙酰-肟法测定大鼠血清肌酐以及尿素氮含量，严格按试剂盒说明书进行操作。2.4肾组织病理染色取左侧肾脏1/4大小组织块，以10%中性福尔马林缓冲液固定，经常规脱水、包埋、切片后分别进行HE和PASM染色。2.5肾组织中Smad通路信号分子蛋白表

4、达分析采用g左右肾组织置于1mlRIPA匀浆缓冲液中匀浆，离心(12000r/min，10min，4℃),留取上清，BCA蛋白检测试剂盒测定裂解液蛋白浓度。按比例加入适量6×SDS上样缓冲液，100℃变性5min，取30μg的组织蛋白样本经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再转移至PVDF膜上(PierceChemicalpany,USA，简称标本膜)。用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭标本膜1h，然后分别加入兔抗p-Smad2抗体(1∶500)、小鼠抗Smad2抗体(1∶1000)、小鼠抗Smad4抗体(1∶2

5、00)、小鼠抗Smad7抗体(1∶500)，4℃孵育过夜，洗膜，再与相应的辣根过氧化物酶耦联的第2抗体室温作用1h，充分洗涤后，用ECL试剂检测标本膜上的信号，X-片记录实验结果。以计算机成像和图像分析仪，测定X-片上杂交条带的光密度值，代表蛋白的表达量。同一张标本膜曝光后以0.5%十二烷基硫酸钠洗脱抗体，再与GAPDH抗体(1∶5000)孵育杂交，作为内参照。每个实验重复3批以上不同样本。2.6统计学方法采用SPSS10.0统计软件包进行ANOVA单因素方差分析。3结果3.1大鼠体重增长、肾脏重量变化比较见表1。造

6、模后大鼠体重增加明显低于正常组与假手术组(P<0.01)，治疗组体重增加高于模型组，但差异无统计学意义。留取左侧肾脏时发现，模型组与治疗组大鼠左侧肾脏较右侧明显增大，颜色变浅，有尿液潴留，肾皮质变薄，肾盂扩张。模型组与治疗组左肾肾体比及左右肾重比均显著高于正常组与假手术组(P<0.01)，模型组与治疗组无明显差异。正常组与假手术组体重增长、左肾肾体比以及左右肾重比均无明显差异。3.2各组大鼠血清肌酐与尿素氮含量比较见表1。模型组、治疗组血肌酐含量显著高于正常组和假手术组，以模型组为重，两组比较有统计学差异

7、（P<0.05或P<0.01）。模型组尿素氮含量显著高于正常组、假手术组与治疗组（P<0.05），治疗组与正常组、假手术组比较差异无统计学差异。正常组与假手术组比较无明显差异。表1各组大鼠体重增长、肾脏重量以及血肌酐、尿素氮测定结果比较与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；左肾肾体比为左肾重量×2与体重之比；n＝63.3各组大鼠肾组织病理检查结果比较见图1。梗阻侧肾组织HE染色和PASM染色可见模型组大鼠肾小管扩张，部分肾小管萎缩，肾小管上皮细胞浊肿，部分坏死与脱落，肾小管基底

8、膜明显增厚；肾间质明显增宽，成纤维细胞增多，炎性细胞浸润，纤维组织增生；皮质中肾小球数量明显减少，肾小球形态基本正常。血府逐瘀胶囊治疗组大鼠皮质中肾小球数量明显多于模型组，肾间质略有增宽，扩张与萎缩的肾小管数量少于模型组，肾小管基底膜轻度增厚，肾小管上皮细胞以变性为主，少见坏死，病变明显轻于模型组(图1)。3.4各组大鼠肾组织中Smad通路信号