王草茎点霉叶斑病病原鉴定及生物学特性

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1、王草茎点霉叶斑病病原鉴定及生物学特性王草茎点霉叶斑病病原鉴定及生物学特性2015年5月，在广西横县出现了成片王草大规模发生叶斑病的情况，且有迅速蔓延之势。为明确其病原，本试验通过病原菌形态学检查，结合分子生物学手段对该致病菌进行了鉴定，进而对其进行了生物学特性研究，以期为当地王草叶斑病害的发生及综合防治提供理论依据。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1供试菌株从广西横县热研4号王草上采集病样，经室内无菌条件下分离及单孢分离纯化得到供试菌株。　　1.1.2供试培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PD

2、A）：马铃薯200g，葡萄糖15～20g，琼脂15～20g，ddH2O定容至1000mL，自然pH值；查氏琼脂培养基（Czapek）：硝酸钠2g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸铁0.01g，蔗糖30g，琼脂15～20g，无菌水定容至1000mL。上述培养基均于121℃高压灭菌20min后备用。　　1.1.3试剂及仪器真菌核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGCGG-3′）和ITS4（5&prim

3、e;-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。Taq酶、PCRbuffer、dNTPs、DNA片段回收试剂盒及T1载体等均购自北京全式金生物试剂公司，其他试剂均为国产分析纯。　　1.2方法　　1.2.1病样采集及病原菌分离纯化采用常规组织分离法进行病原菌的分离纯化[8]。将田间采回的发病王草叶片冲洗干净、晾干，在病健交界处剪取（2～3）mm（2～3）mm的组织块。于超净工作台中，首先用0.1%Hgcl2溶液消毒约1min，然后用75%乙醇漂洗3

4、0s，经无菌水漂洗2～3次后用灭菌滤纸吸干，置于PDA培养基中，在25℃条件下培养2～3d。待菌落长出后，从其边缘挑取菌丝块，置于平板PDA培养基上进行纯化，获得分离菌株。　　1.2.2病原菌形态学鉴定将分离纯化得到的病原菌接种于PDA培养基平板上，25℃培养6～7d，期间观察并记录菌落在培养基上的生长状况；在显微镜下观察菌丝体与分生孢子的形态，测量分生孢子的大小，并拍照保存。　　1.2.3病原菌致病性测定取健康王草嫩叶，先用无菌水洗干净，再经75%乙醇消毒，并再次用无菌水冲洗后晾干。将直径5mm的

5、菌饼接种于经消毒针头刺伤的叶片（菌丝面紧贴在叶片伤口处），每叶接种2块菌饼，重复处理3个叶片，接种无菌培养基块作为对照。于托盘内保湿。接种2d后开始观察发病症状，3d后除去菌丝块，记录病斑大小和颜色。待接种叶片发病后，按照柯赫氏法则，从病部再分离病原菌，观察所得分离物与原接种病原菌的形态特征是否一致。　　1.2.4病原菌分子生物学鉴定　　1.2.4.1病原菌基因组DNA的提取和PCR扩增用真菌DNA提取试剂盒（BiomigaFungalgDNAKit）提取供试菌株DNA，于超微量紫外分光光度计测定D

6、NA浓度及纯度，其余的DNA溶液置于-20℃冰箱保存备用。用引物ITS1/ITS4对其rDNA的2个内转录间区和5.8S区段进行PCR扩增。每个反应体系体积为20μL：10PCR反应缓冲液2μL，dNTPs（10mmol/L）1.6μL，引物ITS1和ITS4（10μmol/L）各0.5μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，DNA模板1μL，ddH2O补足20μL。用双蒸灭菌水代替模板DNA作阴性对照。PCR扩增反应在PCR扩增仪（E

7、ppend本文由.Lastercylergradient）上进行。扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。取5μLPCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，分析PCR产物片段大小，并用凝胶成像系统拍照保存。1.2.4.2PCR产物的回收、克隆及测序PCR产物经电泳分离后，在紫外灯下切下含目的片段的琼脂糖凝胶，转入无菌的微量离心管，用胶回收试剂盒（OMEGAGelExtractionKit）回收纯化，具体操作

8、步骤参见说明书；与T1载体连接后转化感受态DH5α。经蓝白斑筛选后，随机挑取5个白斑，利用通用引物M13F/R对待鉴定的菌液进行PCR鉴定。反应体系以及PCR扩增反应程序参照1.2.4.1节。反应结束后，取5μL扩增产物1.0%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下检查扩增结果。选取阳性克隆，提取质粒DNA，送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。　　1.2.4.3病原菌rDNA-ITS序列系统发育树的构建获得的序列在DNAStar中，利用ITS1、ITS4引物序列去