5 酶工程 山东师范大学

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1、第五章酶分子的化学修饰酶的活性中心酶化学修饰的目的酶化学修饰的原理酶化学修饰的设计酶化学修饰的应用第一节酶的活性中心（activesite）一、活性中心的概念酶的必需基团(essentialgroup):与酶活性有关的基团酶的活性中心(activecenter):由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域.酶分子非必需基团必需基团活性中心必需基团活性中心外必需基团结合基团催化基团非活性中心活性中心活性中心的重要化学基团7种氨基酸出现的频率最高LysAspGluCysHisTyrSer（兰天果拌猪肉丝）某些功能基团,如（氨基、羧基、巯基、羟基和咪唑

2、基）是酶的必需基团。赖氨酸的氨基天冬氨酸和谷氨酸的羧基半胱氨酸的巯基组氨酸的咪唑基酪氨酸和丝氨酸的羟基与底物相结合，使底物与酶的一定构象形成复合物影响底物中某些化学键的稳定，催化底物发生化学反应并将其转化成产物维持酶活性中心应有空间构象所必需的基团二、活性中心的共性(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。(2)活性部位是一个三维实体。(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。(4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。(5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。ActivesiteTheactivesiteisth

3、eregionoftheenzymethatbindsthesubstrate,toformanenzyme-substratecomplex,andtransformsitintoproduct.Theactivesiteisathree-dimensionalentity,oftenacleftorcreviceonthesurfaceoftheprotein,inwhichthesubstrateisboundbymultipleweakinteractions.三、研究酶活性中心的方法1.物理学方法：用X射线衍射法直接检测底物或其类似物与

4、酶形成的中间复合物（包括酶和底物）的相对位置。2.化学修饰法：根据所用修饰试剂不同，分为1)非专一性化学修饰用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。若某基团被修饰后：酶活性不变——该基团可能不是酶的必需基团酶活性降低或丧失——该基团可能是酶的必需基团但不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。活性中心基团的鉴定标准①失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。②S或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。先加S或竞Ⅰ加共价修饰剂透析除去S或竞Ⅰ活性不丧失差别标记：底物或抑制剂存在活性基团不与修饰剂作用去除底物或抑制剂原来被保护的基团带同位素标记可直接得到

5、蛋白质发挥功能作用的必需基团。化学修饰含同位素标记的同样试剂2)专一性化学修饰（基团专一性修饰）用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨基酸残基的侧链基团。3)亲和标记（位点专一性修饰）采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含有活泼反应基团的底物类似物。作用机制：利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记。化学修饰的专一性YYYX-YYYX亲和修饰剂：①与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸残基亲和力小。②具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性中心的基团形成稳定的共价键。3.蛋白质工程：将酶相应的cDNA定点突变

6、，突变的cDNA只表达一个或几个氨基酸被置换的酶蛋白，测定其活性可知被置换的氨基酸是否为活力所必需。第二节酶化学修饰及修饰目的一、酶化学修饰1.限制酶大规模应用的原因：1)细胞外稳定性差；2)酶活性不够高；3)具有抗原性。2.改变酶特性有两种主要的方法：1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。3.酶化学修饰的概念酶的化学修饰（chemicalmodification）：通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价结构发生改变。酶选择性化学修饰：描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修

7、饰。二、酶化学修饰的目的1.研究酶的结构与功能的关系。（50年代末）2.人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围。（70年代末之后）1）提高酶的生物活性（酶活力）。2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。4）产生新的催化能力。第三节酶化学修饰的原理一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。三、如何维持酶

8、功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：1.大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子