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时间:2018-11-18
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1、冲击波干预成人骨髓间充质干细胞后IGF作者:王五洲,邢更彦,叶启彬,白晓东,姜川【关键词】体外冲击波;骨髓间充质干细胞;胰岛素样生长因子Ⅰ;转化生长因子β1 摘要:[目的]在体外成功分离培养骨髓间充质干细胞(hMSCs)和测得理想冲击波(ESSCs增殖活性,IGFⅠ和TGFβ1等的不同时期和不同程度表达是体外冲击波促进hMSCs成骨活动的适时信号和有力证据。关键词:体外冲击波;骨髓间充质干细胞;胰岛素样生长因子Ⅰ;转化生长因子β1Abstract:[Objective]Todemonstratemecha
2、nismofESSCs)arroentoptimalexperimentalenergy,adoseof5kVand100timesofESSCsproliferation,anmesencbymalstemcells(hMSCs),InsulinlikegroingGropus,日本);台式高速离心机(DAMON/IEC,美国);细胞培养箱(HERACell150型,德国);生物安全柜(HealForce,德国);培养瓶、皿(Corning,美国);多孔培养板(Costar,美国);电热恒温振荡器(THZ
3、C型):EMLG培养基(Gibco,美国);优质胎牛血清(江苏四季青);胰蛋白酶(Amresco,美国);亲和纯化兔抗人IGFⅠ和TGFβ1抗体(武汉博士德生物公司);生物素化羊抗兔IgG(武汉博士德生物公司:多聚甲醛和DAB显色试剂盒(北京鼎国生物):青链霉素双抗(吉诺生物医药公司)。12骨髓标本的获取取自年龄18~45岁的早期成人股骨头缺血性坏死患者,经辅助检查排除血液及其他脏器病变,双方签署知情同意书;自髂前上棘处骨髓穿刺,用肝素化(200U/ml)的50ml注射器抽出骨髓20~30ml,立即注入肝素
4、化的灭菌标本瓶中充分混匀;于超净工作台内尽快行分离操作。13骨髓间充质干细胞的分离根据密度梯度分离的原理和Stokes定律,骨髓中的单个核细胞将会停留在密度为1073~1077g/ml的分层界面;实验中选用Percoll液进行骨髓间充质干细胞分离;按照Percoll梯度分离液配制公式,用10×PBS将Percoll原液稀释成60%浓度的梯度分离液,调节pH至72,并以1%的Ca2+/Mg2+液调节渗透压至295~310mOsmol/L。将抗凝的骨髓血稀释,1000r/min,离心Stain,去除上层脂肪滴;
5、将余下的内容物重悬,并沿管壁缓慢加入含等量细胞分离液的离心管中,甩平头梯度离心(2000r/min,R=175mm,20min),观察分层情况,仔细吸取分层界面的云雾状悬液,PBS漂洗2次(1500r/min,R=80mm,10min),加入DMEMLG完全培养基,反复抽吸吹打制成单细胞悬液,计数培养。14受试对象的分组及干预原代hMSCs长满至80%时,加入025%胰蛋白酶-001%EDTA消化制成细胞悬液,即P1代;调整细胞密度在1~15×105个/ml的水平,然后各取5ml细胞悬液,等量接种于25cm
6、2细胞培养瓶中,分别标记为对照组(C)和干预组(E)。干预组hMSCs使用ESSCs隔代染色,观测细胞膜、浆或核中IGFⅠ和TGFβ1等成骨活性因子表达。使用IGFⅠ和TGFβ1单克隆抗体及相应SABC免疫组化试剂,按照免疫组化染色实验操作流程摸索适宜条件,并在同一批次用005mol/LPBS代替一抗作为空白对照。具体步骤如下:细胞传代时取干预组和对照组hMSCs悬液,分别接种在预先灭菌的24孔培养板,37℃、5%CO2及饱和湿度条件的孵育箱培养72h,4%多聚甲醛固定30min,PBS冲洗5min,共3次
7、;03%的H2O2甲醇溶液封闭内源性过氧化物酶30min,蒸馏水洗3次;滴加5%BSA封闭液,室温20min,甩去过多液体,不洗;干预组和对照组分别滴加兔抗人IGFⅠ、TGFβ1一抗(各5孔,并设PBS对照1孔),4℃过夜,PBS漂洗2min,共3次;滴加生物化山羊抗兔二抗IgG50μl,室温孵育20min,PBS漂洗2min,共3次;滴加SABC50μl,室温孵育20min,PBS漂洗5min,共4次;DAB试剂盒显色9min,显微镜下观察,适时蒸馏水冲洗。苏木精轻度复染细胞核1min,95%和99%酒精
8、梯度脱水各两次,每次1min;显微镜下观察:①细胞膜、胞浆或胞核被DAB染成棕黄色或棕褐色;②细胞核比较清晰;③形状比较规则;④轮廓比较清楚,即为表达阳性,未显棕黄色者为阴性;如果细胞核阳性,则放弃苏木素复染,以免影响结果观察。再根据颜色的深浅将阳性表达分为4级:微阳性(+)、弱阳性(++)、中度阳性(+++)、强阳性(++++)。计数每组高倍镜视野下1000个细胞中的阳性细胞数,计算该组的阳性率。16数据分析数
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