冲击波干预成人骨髓间充质干细胞后igf

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1、冲击波干预成人骨髓间充质干细胞后IGF作者：王五洲，邢更彦，叶启彬，白晓东，姜川【关键词】体外冲击波；骨髓间充质干细胞；胰岛素样生长因子Ⅰ；转化生长因子β1　　摘要：［目的］在体外成功分离培养骨髓间充质干细胞（hMSCs）和测得理想冲击波（ESSCs增殖活性，IGFⅠ和TGFβ1等的不同时期和不同程度表达是体外冲击波促进hMSCs成骨活动的适时信号和有力证据。关键词：体外冲击波；骨髓间充质干细胞；胰岛素样生长因子Ⅰ；转化生长因子β1Abstract：［Objective］Todemonstratemecha

2、nismofESSCs）arroentoptimalexperimentalenergy,adoseof5kVand100timesofESSCsproliferation,anmesencbymalstemcells（hMSCs）,InsulinlikegroingGropus，日本）；台式高速离心机（DAMON/IEC，美国）；细胞培养箱（HERACell150型，德国）；生物安全柜（HealForce，德国）；培养瓶、皿（Corning，美国）；多孔培养板（Costar，美国）；电热恒温振荡器（THZ

3、C型）：EMLG培养基（Gibco，美国）；优质胎牛血清（江苏四季青）；胰蛋白酶（Amresco，美国）；亲和纯化兔抗人IGFⅠ和TGFβ1抗体（武汉博士德生物公司）；生物素化羊抗兔IgG（武汉博士德生物公司：多聚甲醛和DAB显色试剂盒（北京鼎国生物）：青链霉素双抗（吉诺生物医药公司）。12骨髓标本的获取取自年龄18~45岁的早期成人股骨头缺血性坏死患者，经辅助检查排除血液及其他脏器病变，双方签署知情同意书；自髂前上棘处骨髓穿刺，用肝素化（200U／ml）的50ml注射器抽出骨髓20~30ml，立即注入肝素

4、化的灭菌标本瓶中充分混匀；于超净工作台内尽快行分离操作。13骨髓间充质干细胞的分离根据密度梯度分离的原理和Stokes定律，骨髓中的单个核细胞将会停留在密度为1073~1077g／ml的分层界面;实验中选用Percoll液进行骨髓间充质干细胞分离；按照Percoll梯度分离液配制公式，用10×PBS将Percoll原液稀释成60%浓度的梯度分离液，调节pH至72，并以1%的Ca2+／Mg2+液调节渗透压至295~310mOsmol／L。将抗凝的骨髓血稀释，1000r／min，离心Stain，去除上层脂肪滴；

5、将余下的内容物重悬，并沿管壁缓慢加入含等量细胞分离液的离心管中，甩平头梯度离心（2000r／min，R=175mm，20min），观察分层情况，仔细吸取分层界面的云雾状悬液，PBS漂洗2次（1500r／min，R=80mm，10min），加入DMEMLG完全培养基，反复抽吸吹打制成单细胞悬液，计数培养。14受试对象的分组及干预原代hMSCs长满至80%时，加入025%胰蛋白酶-001%EDTA消化制成细胞悬液，即P1代；调整细胞密度在1~15×105个／ml的水平，然后各取5ml细胞悬液，等量接种于25cm

6、2细胞培养瓶中，分别标记为对照组（C）和干预组（E）。干预组hMSCs使用ESSCs隔代染色，观测细胞膜、浆或核中IGFⅠ和TGFβ1等成骨活性因子表达。使用IGFⅠ和TGFβ1单克隆抗体及相应SABC免疫组化试剂，按照免疫组化染色实验操作流程摸索适宜条件，并在同一批次用005mol／LPBS代替一抗作为空白对照。具体步骤如下：细胞传代时取干预组和对照组hMSCs悬液，分别接种在预先灭菌的24孔培养板，37℃、5%CO2及饱和湿度条件的孵育箱培养72h，4%多聚甲醛固定30min，PBS冲洗5min，共3次

7、；03%的H2O2甲醇溶液封闭内源性过氧化物酶30min，蒸馏水洗3次；滴加5%BSA封闭液，室温20min，甩去过多液体，不洗；干预组和对照组分别滴加兔抗人IGFⅠ、TGFβ1一抗（各5孔，并设PBS对照1孔），4℃过夜，PBS漂洗2min，共3次；滴加生物化山羊抗兔二抗IgG50μl，室温孵育20min，PBS漂洗2min，共3次；滴加SABC50μl，室温孵育20min，PBS漂洗5min，共4次；DAB试剂盒显色9min，显微镜下观察，适时蒸馏水冲洗。苏木精轻度复染细胞核1min，95%和99%酒精

8、梯度脱水各两次，每次1min；显微镜下观察:①细胞膜、胞浆或胞核被DAB染成棕黄色或棕褐色;②细胞核比较清晰；③形状比较规则；④轮廓比较清楚，即为表达阳性，未显棕黄色者为阴性；如果细胞核阳性，则放弃苏木素复染，以免影响结果观察。再根据颜色的深浅将阳性表达分为4级：微阳性（+）、弱阳性（++）、中度阳性（+++）、强阳性（++++）。计数每组高倍镜视野下1000个细胞中的阳性细胞数，计算该组的阳性率。16数据分析数