药用植物胡黄连issr

《药用植物胡黄连issr》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、药用植物胡黄连ISSR作者：刘小莉普春霞杨耀文钱子刚【摘要】目的优选胡黄连稳定的ISSR-PCR反应体系。方法采用4因素（dNTPs、Mg2+、Taq酶、引物）4水平的正交实验和单因子梯度优化相结合的方法。结果适于胡黄连的25μl的ISSR-PCR反应体系中各因素最佳浓度分别为10×buffer2.5μl,dNTPS150μmol/L,Mg2+1.5mmol/L,Taq酶1U，引物0.5μmol/L,DNA20ng或10×buffer2.5μl,dNTPs150μmol/L,Mg2+2mmol/L,Taq酶0.5U，引物0.5μmol/L,DNA20ng。结论对于胡

2、黄连ISSR-PCR实验，一次正交实验完全可以建立起满足要求的PCR体系。【关键词】胡黄连；正交实验；单因子；ISSR-PCR　ISSR是Zietke,凭证标本保存于云南中医学院中药学院)的胡黄连幼嫩叶片，硅胶干燥后保存于-20℃冰箱中。ISSR引物参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)提供的序列由上海生物工程公司合成。PCR反应相关试剂购自大连宝生物工程有限公司，PCR反应在BiometraPCR仪上进行。　　2方法　　2.1基因组DNA提取与检测采用CTAB法，略加改良。1%琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，总DNA用无菌双蒸水稀释到10ng/μl，-20℃冰箱保存。　　2

3、.2反应体系正交实验初选本研究参考豇豆［16］、玄参［17］、石斛［18］、永瓣藤［19］、黄连［20］的ISSR反应条件，初步确定dNTPs、Taq酶、Mg2+、引物浓度各4个水平。见表1。按照L16（4）正交表形成16个组合的实验方案。见表2。表1用于胡黄连1SSR-PCR正交实验的4因子4水平，表2胡黄连ISSR-PCRL16（4）正交实验各组合（略）。　　2.3单因子梯度实验本研究在正交实验所初选的PCR反应体系的基础上，对单个因子又设置了一定的梯度，以进一步优化所初选的反应体系，并比较单因子浓度对反应体系的影响。PCR总体积为25μl，其中dNTPs设置了

4、0.1，0.125，0.15，0.175，0.2mmol/L5个浓度梯度；Mg2+设置了1，1.25，1.5，1.75，2mmol/L5个浓度梯度；TaqDNA酶设置了0.5，0.75，1，1.25，1.5，2U6个浓度梯度；引物设置了0.3，0.35，0.4，0.45，0.5μmol/L5个浓度梯度；模板设立了10，20，30，40，50，100ng6个浓度梯度。　　2.4PCR扩增与产物检测反应通过引物筛选后，选用引物856（序列为5’-3’ACACACACACACACACYA）为ISSR-PCR反应体系优化的引物。反应体系为25μl,内含10×PCRbuffe

5、r2.5μl,DNA20ng,其余成分按照表2进行。反应程序:94℃预变性5min,94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸2min，循环35次，72℃延伸5min，4℃保存。PCR产物均在含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中，以0.5×TBE为电泳缓冲液电泳分离，最后用紫外成像系统(TanonGIS-2009)观察并成像。　　3结果　　3.1正交实验结果　　正交试验结果从图1直观可见，16个组合中除了9号和13号以外，均有扩增产物，但1，2，3，4，7，8，14，15，16号所扩增的条带较弱，无法统计，予以淘汰。5，6，10，11，12号均扩增出了清晰的条带

6、，且条带数较多，但10，11，12号非特异性扩增严重，图谱背景模糊，亦予以淘汰。5，6号扩增条带相似，均为6条亮度适中、分离较好的条带。综上所述，本研究确定5号和6号为最理想的反应体系。　　3.2Taq单因子浓度梯度下扩增产物比较在对dNTPs、Mg2+、引物、Tag酶、模板5个因子进行了梯度对比后发现，各个因子的浓度均在较大的范围内对扩增产物不造成显著影响。dNTPs是PCR的原料，浓度太高容易产生错误掺入，浓度太低产率太低，常用的是0.05～0.2mmol/L［21］。本实验发现胡黄连PCR扩增中100～300mmol/L的dNTPs均产生了一致的扩增条带。Mg

7、2+在1～2mmol/L浓度内均扩增出了6条带，只是在低浓度（1～1.5mmol/L）下扩增谱带的清晰度较之高浓度（1.75和2mmol/L）条件下略差。引物的浓度会影响PCR扩增的特异性,在胡黄连的ISSR-PCR扩增中引物浓度在5个浓度下（0.3～0.5μmol/L）的扩增谱带无显著差异。对大多数物种来说Taq酶浓度变化对试验结果影响较大，酶用量过高会造成非特异扩增，过低则会降低产物合成效率，在本实验25μl的反应体系中，从0.5U到2U的范围内扩增条带基本一致，且0.5U下扩增图谱清晰、条带强。一般认为模板浓度对反应体系的影响不大，本试验亦证明了这一点，在