mmp2、mmp9和vegf在肾癌中的表达与临床意义论文

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1、MMP2、MMP9和VEGF在肾癌中的表达与临床意义论文卜宏民王连渠闫拥军焦志灵徐国良【摘要】目的探讨基质金属蛋白酶2、9(MMP2、MMP9)与血管内皮生长因子（VEGF）在肾癌组织中的表达与临床分期的意义。方法蛋白免疫印迹法、ELISA和逆转录聚合酶链反应法（RTPCR）检测癌组织MMP2、MMP9，蛋白质免疫印迹法和RTPCR检测癌组织VEGF。结果肾癌组织中MMP2、MMP9和VEGF明显表达，随着病程的进展MMP2、MMP9和VEGF活性逐渐增高，以Ⅳ期晚期最明显，VEGF与MMP2、MMP9表达具有正相关性。结论MMP2、MMP9

2、和VEGF参与了肾癌临床病情进展和发病机制。【关键词】肾癌；基质金属蛋白酶；血管内皮生长因子基质金属蛋白酶(MMP2和MMP9）及其组织抑制物因子(TIMPs)在恶性肿瘤浸润转移中的作用已成为研究热点〔1，2〕，其中能够水解基底膜主要成分Ⅳ型胶原的MMP2(明胶酶A)、MMP9(明胶酶B)由于参与了细胞外基质(ECM)的降解和血管的发生，被认为在恶性肿瘤的浸润转移中发挥重要的作用〔2〕。血管内皮生长因子（VEGF）是一种增加血管通透性并促进新血管生长的细胞因子.freelm)；Ⅱ期：肾壁厚＞5mm，但未侵及纵隔，也无远处转移；Ⅲ期：肾壁厚＞5mm，侵犯周围组织，也可以有

3、纵隔淋巴结肿大，但无远处转移；Ⅳ期：肾壁厚＞5mm，不但侵犯周围组织，且有远处转移。1.2方法1.2.1ELISAMMP2、MMP9和VEGF抗体和酶联免疫吸附法试剂盒购自福建迈新生物科技发展有限公司。液氮罐保存肾癌组织按2.5ml/g质量加入相当体积的冰生理盐水，用匀浆器将组织研磨，然后在冰浴下超声波粉碎制成匀浆，4℃，10000r/min离心10min，取上清液。实验严格按照MMP2、MMP9和VEGF酶联免疫吸附法说明书步骤进行。1.2.2MP2、MMP9、VEGF含量。按10ml/g的比例加入全细胞裂解液，组织经匀浆、超声破碎后，用二喹啉甲酸（BCA）法进行

4、蛋白定量。10％的十二烷基硫酸钠聚丙稀酰胺凝脑电泳（SDSPAGE）法上样量为28μg。电泳条件:4℃。电流20～30mA。电泳结束后，进行蛋白质转膜。转膜条件：采用孔径为0.22m的硝酸纤维素膜(NC)，4℃,电流400mA，转膜3h。BP(1∶1000)杂交反应3h，吐温20/Tris盐酸缓冲液（TTBS）漂洗同前。再将NC膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶5000)杂交反应1h。最后用TTBS漂洗NC膜3次，每次10min，加入ECL试剂反应5min，保鲜膜包裹，暗室X光胶片曝光、显影和定影。然后同一张NC膜再与βactin(1∶1000)进行MP2、M

5、MP9和VEGFPCR引物设计见表1(北京奥科生物科技有限公司)。将PCR扩增的产物5μl在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压一般为70～80V。电泳完毕后，取出凝胶在紫外灯下观察结果并照相。结果用QuantityOne4.4.0软件行定量分析，以目的基因与βactin条带平均光密度比值表示目的基因mRNA的相对表达量。表1MMPs和VEGFPCR引物设计1.3统计学处理数据以x±s表示，采用SPSS11.0软件包进行统计学处理，组内不同时相点的比较采用方差分析，组间同一时相点的比较采用t检验，OneRNAMMP2/MMP9和VEGF的表达水平与蛋白质表达水平结果也具

6、有一致性，MMP2/MMP9和VEGF在Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期肾癌组织中明显表达，尤其Ⅳ期肾癌组织中表达最明显(P＜0.01)。图2和表4。表4mRNA水平比较MMP2/MMP9和VEGF的表达3讨论ECM是肿瘤转移的主要屏障。MMPs是降解ECM最重要的酶类。MMPs活性上调与肿瘤侵袭、转移有关。金属蛋白酶组织抑制剂TIMPs作为MMPs的天然抑制物，可下调MMPs活性，对维持ECM具有重要作用。活化的MMPs与TIMPs的平衡关系受到破坏，提示有肿瘤侵袭和转移的可能性。基质金属蛋白酶是一个依赖锌离子的肽链内切酶基因家族，目前已发现17种，几乎可以降解ECM的所有成分。MMP

7、9也称明胶酶或Ⅳ型胶原酶，分子量为92kD。MMP9可降解Ⅲ、Ⅳ、V型胶原、明胶等多种底物，而IV型胶原构成基膜的主要支架。因此其在肿瘤发生发展及侵袭过程中起着非常重要的作用。MMPs在肿瘤组织中的表达和分布报道不一。大多数研究认为，明胶酶、间质溶素主要表达于间质细胞，基质溶素(MMP7)是由肿瘤细胞分泌的〔5，6〕，肿瘤细胞和间质细胞可通过多种机制相互作用而影响MMPs与TIMPs的表达和分布。生长因子及细胞因子以旁分泌或自分泌的方式影响MMPs的表达，而MMPs与TIMPs可调节肿瘤