大孔树脂分离纯化翻白草中总黄酮优化工艺研究

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1、大孔树脂分离纯化翻白草中总黄酮优化工艺研究李胜华，伍贤进，刘惠君【摘要】　　目的研究大孔吸附树脂分离纯化翻白草中总黄酮的工艺条件。方法比较AB-8，NKA，NKA-9，D-152，D-101，ADS-17等6种大孔吸附树脂对翻白草总黄酮的静态解吸率。结果D-101型树脂对翻白草中总黄酮有最好的吸附分离性能。D-101型大孔树脂分离纯化翻白草黄酮的最佳工艺条件为:柱体积为160ml,翻白草提取物上样量为62.5mg/ml(以湿树脂体积计),先用pH4的蒸馏水淋洗,再用30%的乙醇洗脱,洗脱剂用量为2.5～3倍湿树脂体积。结论D-101型树脂是

2、分离纯化翻白草黄酮的适宜大孔树脂，纯度超过60%，此工艺可行。【关键词】翻白草总黄酮大孔吸附树脂分离纯化　　大孔吸附树脂是一类有机高聚物吸附剂,近年来被广泛应用于天然产物的分离〔1〕。根据其孔径，比表面积构成类型分为许多类型。翻白草为蔷薇科委陵菜属多年生草本植物〔2〕，主要成分为乌苏酸和大量的黄酮类化合物。近年来，翻白草更多的药用价值被发现，民间流行用翻白草治疗糖尿病并取得不错的疗效。翻白草醋酸乙酯萃取物有较强的降血糖作用，能调血脂、清除自由基、抑菌等，且毒性极小。翻白草的主要药理活性成分为黄酮类物质〔3～5〕。近年来有关翻白草中黄酮类的测

3、定与分析时有报道〔6～7〕，但是尚未见采用大孔树脂分离纯化翻白草中总黄酮的系统报道，故本实验对AB-8，NKA，NKA-9，D-152，D-101，ADS-17等6种树脂进行筛选，旨在探索适合分离纯化翻白草中总黄酮类物质的最佳大孔树脂及纯化的最佳工艺。最终筛选得到对翻白草中总黄酮有最好的吸附分离性能树脂，且分离和纯化翻白草中黄酮类成分(以翻白草总黄酮为主)纯度达到62.48%,为纯化翻白草提取物奠定了基础。　　1仪器与试药　　752p紫外分光光度仪（上海光谱仪器有限公司）；AL104电子天平（Mettler-Toledo仪器公司）；KQ-5

4、00DE型医用超声波清洗机（昆山超声仪器有限公司）；DF-101B集热恒温磁力搅拌器（浙江乐清市乐成电器厂）；TDZ5—in,过滤，减压浓缩回收乙醇，静置冰箱过夜，过滤除去叶绿素备用。　　2.2标准曲线的制备　　精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品10.00mg，置于50ml的容量瓶中，加95%的乙醇30ml，置于水浴上微热溶解，放冷，加乙醇稀释至刻度，摇匀，即为浓度为0.2mg/ml的芦丁标准品溶液。精密量取已制备的对照品溶液0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0ml，分别置于10ml具塞试管中，加1.0ml亚硝酸钠(1：20

5、)溶液，混匀，放置6min，加0.5ml硝酸铝(1：10)溶液,混匀，放置6min，加1mol/L的氢氧化钠4ml，再加水至刻度，摇匀，放置15min，用分光光度法在λ＝500nm处测定吸光度，用最小二乘法作线性回归得芦丁浓度（Y）与吸光度（X）的关系曲线的回归方程式：Y＝0.8577X-0.0005，R2＝0.9992。　　2.3大孔树脂的处理　　将AB-8，NKA，NKA-9，D-152，D-101，ADS-17大孔树脂依次用2倍体积5%NaOH水溶液浸泡24h，1倍体积蒸馏水，2倍体积10%盐酸洗涤，最后用蒸馏水洗至中性。以乙醇湿法装

6、柱，用93%乙醇在柱上流动淋洗，不时检查流出的乙醇液，至乙醇液与水混合(1∶5)无白色浑浊为止，然后以大量蒸馏水洗去乙醇。　　2.4大孔树脂的筛选　　将浓度为50mg/ml的翻白草提取物水溶液分别通过6种不同型号的已预处理好的树脂柱，进行动态吸附。用1%FeCl3检查流出液,待反应呈阳性(检测显色)时，表明已有黄酮流出,树脂吸附达饱和，停止上样,记录上柱量，计算总黄酮吸附量，单位为mg/ml。上样后的树脂柱先用水洗至无色并用浓硫酸检测至无糖反应，再用93%乙醇洗脱至洗脱液无色止。将乙醇洗脱液蒸干、称重、测定总黄酮含量、计算总黄酮回收率。总黄

7、酮吸附量及总黄酮回收率分别按公式(1)和(2)计算:A=BV(1)R=(ET)×100(2)　　式中A:总黄酮吸附量（mg/ml）；B:被树脂吸附的黄酮总量（mg）；V:湿柱体积（ml）；R:总黄酮回收率（%）；E:93%乙醇洗脱液中黄酮总量（mg）；T:上柱总黄酮量（mg）。　　2.5D-101大孔树脂柱纯化翻白草黄酮类化合物工艺的确定　　2.5.1上柱条件的确定分别称取5.07，10.01，15.17，20.53g粗提物,溶于50ml水中，上柱(柱体积为160ml)，吸附30min后，先用大量水淋洗，直到洗脱液无色并用浓硫酸检测不出糖为

8、止，然后用93%的酒精洗脱至AlCl3检测呈阴性(不显色)，收集洗脱液,测总黄酮含量和回收率。　　2.5.2淋洗pH值的确定称取10g粗提物，溶于50ml水中，上柱后，分别用不同