邻苯二甲酸二丁酯雄性生殖毒性分子作用机制

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1、邻苯二甲酸二丁酯雄性生殖毒性分子作用机制作者：敖红，林玲，阚海东，陈秉衡，张蕴晖【摘要】目的研究邻苯二甲酸酯类对大鼠睾丸毒性作用的分子机制。方法运用RT-PCR方法观察邻苯二甲酸二丁酯(DBP)对大鼠子代不同发育阶段睾丸的苗勒氏管抑制物质(MIS)、雄激素结合蛋白(ABP)和抑制素(inhibin)表达水平的影响，并采用ELISA法检测DBP染毒后大鼠睾酮水平的变化情况。结果与对照组比较，各DBP染毒组大鼠睾丸中MIS表达差异无统计学意义，血清总睾酮水平差异无统计学意义，但高剂量DBP(1000mg/kg)组睾丸支持细胞中ABP和抑制素

2、(inhibin)的mRNA表达量显著减少，且与睾丸损害呈时间-效应关系。结论环境内分泌干扰物DBP可干扰大鼠发育过程中睾丸支持细胞ABP和inhibin的表达，其对性腺发育的影响可能是DBP雄性生殖毒性的主要作用机制之一。【关键词】邻苯二甲酸酯类　　近年来，塑料增塑剂邻苯二甲酸二丁酯(DBP)被认为是一种环境内分泌干扰物，主要表现为雄性生殖发育毒性(染毒大鼠睾丸萎缩、附睾发育不良、尿道下裂等)〔1，2〕。本研究以DBP为邻苯二甲酸酯类(phthalates)的代表物，观察DBP对发育过程中F1代幼鼠睾酮(T)水平和雄激素结合蛋白(An

3、drogen-bindingprotEin,ABP)、抑制素(inhibin)、苗勒氏管抑制物质(MIS)基因表达影响，从调控雄性生殖系统的下丘脑-垂体-性腺轴角度探讨其生殖发育毒性的作用机制。　　1材料与方法　　11试剂DBP(分析纯，纯度≥995%，上海溶剂厂)；吐温-80(化学纯，符合Q/CYDZ-162-97，中国医药集团上海化学试剂公司)；市售精制大豆油；大鼠睾酮酶联免疫试剂盒(美国Biotech公司)；单克隆兔抗带状闭合蛋白1(zonacocludens1)，ZO1)抗体(美国ZymedLaboratories公司

4、)和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC山羊抗兔IgG)(北京中山生物医学有限公司)。　　12剂量设置及试剂配制共设3个染毒组，DBP染毒剂量依次为50，200，1000mg/kg。另设1个溶剂对照组(0mg/kg)。准确称取100gDBP置入干净的烧杯中，按1∶2比例加入吐温80和精制植物油，定容至500ml，为高剂量组；依次配制中剂量和低剂量组，溶剂对照组用1∶2的吐温80和植物油加蒸馏水配制而成，其中吐温80和植物油的用量同高剂量组。　　13动物来源及染毒方法　　131实验动物SPF级Sprague-Dal/(100g

5、·ber5引物设计软件自行设计ABP、Inhibinα和MIS的引物序列。βactin(470bp):Sequence5′CGGATGTCCACGTCACACTT3,antisequence5′GTTGCTATCCAGGCTGTGCT3′;ABP(286bp):Sequence5′ATCAACTGCTTGGGGTTCAC3′,antisequence5′GAGCCTGGTCAGAGGCATAG3′;Inhibinα(208bp):Sequence5′GCTCTACCAGGGAGCATGAG3′,anti

6、sequence5′CACCTTCCTCCTAGCTGACG3′;MIS(307bp):Sequence5′AGCAAGGCTTCCCTGACGGT3′,antisquence5′CAGGGTATA　GCACTAACAGG3′;GAPDH(153bp):Sequence5′GTGCTGAGTATGTCGTGGAG3′,antisequence5′TGTCATATTTCTCGTGGTTC-3′。　　17RTPCR程序向RTPCR反应液中加入1μl的引物及3μl的模板，混匀后放入PCR仪中反应。PCR扩增条件：5

7、0℃逆转录30min；94℃预变性2min；94℃30s，55～64℃30s［βactin和ABP的退火温度为56℃，inhibin、MIS和内标磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde3PhosphateDehydrogenase,GAPDH)的退火温度为58℃］，72℃60s,30～35次循环；72℃延伸10min。取5μl水浴产物与1μl加样缓冲液混匀，加至凝胶的加样孔中，电泳。电泳15～30min后在紫外灯下观察结电泳结果，在凝胶成像系统下成像扫描目标DNA片段的灰度，进行半定量分析。　　18统计方法采用SPSS1

8、10软件，进行方差分析。　　2结果　　21PND1dF1代大鼠睾丸MIS表达(图1、表1)结果可见，片断长度为304bps的性别分化相关基因MIS在对照组和各DBP染毒组大鼠睾丸中表达差异无统计学意义。