人脂肪干细胞向内皮分化最佳诱导体系的建立

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1、人脂肪干细胞向内皮分化最佳诱导体系的建立作者：杨旭芳何旭何牮张慕蕊张丽红李玉林【摘要】目的探讨人脂肪干细胞(humanAdiposederivedstemcells，hADSCs)体外分化为内皮细胞的最佳诱导体系。方法利用胶原酶消化法和贴壁筛选法从人脂肪组织中分离、培养及扩增hADSCs，分3组分别进行内皮诱导：即纤维连接蛋白(fibronectin,FN)包被组、明胶包被组和未铺组;同时诱导液分为两组：单纯内皮细胞生长培养基(EGM2MV)组及内皮细胞生长培养基(EGM2MV)+50ng/ml血管内皮细胞生长因子(VEGF165)组。诱导15d

2、后，通过流式细胞术检测各组内皮细胞特异性表面抗原CD34的表达;通过相差显微镜观察诱导前后细胞的一般形态学特征。结果体外分离、培养出高度同源性的hADSCs，CD29、CD44、CD90、CD105及CD166呈阳性表达，而CD34、CD45及HLADR呈阴性表达;诱导后细胞流式结果显示单纯EGM2MV诱导的3组细胞内皮细胞特异性标志CD34阴性表达，而EGM2MV+50ng/mlVEGF165诱导的细胞,其中FN包被组CD34表达率为8.4%，明胶包被组为5.4%，未铺组为4.2%;相差显微镜下可见诱导后细胞呈三角形或多边形，融合处呈铺路石样生

3、长。结论FN作为细胞外基质与EGM2MV+50ng/mlVEGF165组成的诱导液协同作用，构成了hADSCs体外分化为内皮细胞的最佳诱导体系，可为临床上缺血性疾病的自体细胞移植治疗提供大量的种子细胞来源。【关键词】人脂肪干细胞;流式细胞术;内皮分化;诱导体系　　【Abstract】ObjectiveTodiscussthebestmethodforendothelialdifferentiationofhumanadiposederivedstemcells(hADSCs).MethodshADSCshumanadiposetissuebycol

4、lagenasedigestionandadherencetoflasks,dividedintothreegroupsandinducedintoendotheliarespectively,includingFibronectin(FN)coated,gelatincoatedgroupandnoncoatedgroup.Atthesametime,inducingmediumedium(EGM2MV)andendothelialcellgroedium(EGM2MV)+50ng/mlvascularendothelialgroetry.

5、GeneralmorphologicalcharacteristicsofhADSCsandinducedhADSCsicroscope.ResultsAhighdegreeofhomologyandtheCD34negativehADSCspleEGM2MVallsholVEGF165sholVEGF165isthebestmethodforendothelialdifferentiationofhADSCs.Theresultsicdisease.　　【Keyanadiposederivedstemcells(hADSCs);Floetry;E

6、ndothelialdifferentiation;Inductionsystem　缺血性疾病是当今世界的常见病之一，尤以动脉粥样硬化性血管疾病为主要代表。目前常用的药物疗法不能彻底解决已经发生狭窄的血管解剖结构，而动脉搭桥术又面临着远期通畅率不够理想等问题，因此寻找新的治疗方法和移植材料已成为晚期缺血性疾病研究的重要课题。近年来随着干细胞研究的进展，将干细胞作为种子细胞为缺血组织血管新生(vasculogenesis)提供了新机遇〔1，2〕，但如何便捷有效地获取种子细胞,是影响组织工程血管应用于临床的一个重要问题。本实验旨在探讨人脂肪干细胞(huma

7、nAdiposederivedstemcells，hADSCs)向内皮分化的最佳诱导体系，为临床上各种晚期缺血性疾病患者提供取材方便、适于体外大量培养增殖、无免疫原性的可供自体移植的种子细胞。　　1材料与方法　　1.1主要试剂LGDMEM、10%优质胎牛血清(Hyclone,USA)，0.25%胰酶、胶原酶Ⅰ(Invitrogen)，小鼠抗人单克隆抗体CD44、CD90及CD166(BD,USA)，小鼠抗人单克隆抗体CD29、CD105、CD34、CD45、HLADR(BioLegend,USA)，EGM2MV(Lonza,USA)，VEGF1

8、65(Peprotech，USA)。　　1.2hADSCs的分离与培养及鉴定　　1.2.1hA