马铃薯青枯病关键防卫基因生物信息学概述及验证

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1、马铃薯青枯病关键防卫基因生物信息学概述及验证1绪论1.1前言马铃薯（Solanumtuberosum）是重要的粮菜兼用作物，其栽培种起源于秘鲁南部，最原始的栽培种窄刀种（S.stenotomum）是由薄叶薯（S.leptophyes）变异产生的[1]。它具有营养丰富、经济效益高、适应性强、丰产性好、适于加工等优点，是世界范围内重要的粮、菜、饲料和工业原料兼用作物。目前它在食物安全结构中具有举足轻重的地位[2]。马铃薯青枯病（BacterialusananaLour.）、草霉（StraphytumofficinaleL.）

2、以及一些贵重药材和花卉植物等50个科近450种植物[3]，马铃薯种植和生产常受青枯病的严重威胁。青枯菌致病机理：青枯菌在感染植物前，长期潜伏于杂草、土壤等自然环境中，当温度和湿度等外景环境适宜时，从寄主的伤根处侵入，先在根皮层细胞间隙繁殖，随后，在导管周围迅速扩散、增殖，寄主维管系统阻塞和破坏，导致其缺水性死亡[4]。因此，加快疾病控制和抗病育种研究变得十分的重要，这急需阐明马铃薯与青枯病相互作用的分子机制，运用抗性基因改造马铃薯抗病遗传的结构。而分析马铃薯受青枯菌诱导产生的防卫基因的生物信息学特征，有助于了解这些防卫基

3、因在马铃薯青枯病抗性中的作用，为以后的马铃薯抗病育种提供理论依据。..1.2研究进展开心蛋白（Yippeeprotein）属于Yippee-like（YPEL）家族，该家族具有高度保守的锌结合域，广泛分布于动、植物等真核生物中[5]。最初，研究者研究hemolin的功能时发现Yippee基因的，它是一种动物防卫相关基因[6]。通过酵母双杂交作用绘制的果蝇蛋白互作图谱表明，Yippee基因与CGl5676基因和心脏发育相关基因等有联系，表明Yippee基因可能参与心脏发育调节基因的信号途径[7]。Kelley等发现Yipp

4、ee-like3是p53抑制子的一个调控基因，p53抑制子参与细胞衰老信号转导途径，在抑制细胞再生时起关键作用[8]；Berberich等发现p53家族成员p73和p63可使Yippee-like3上调表达，表明Yippee-like3是一个肿瘤调控抑制基因[9]。最近，Velusamy等把YPEL5/PPP1CB嵌合体导入哺乳动物细胞时，PPP1CB蛋白下调表达，细胞增殖增强，形成MEC1和JVM3细胞，证明YPEL5在人类慢性淋巴细胞白血病发病机理中具有重要的作用[10]。开心蛋白在人类和动物抗癌免疫方面研究较多[1

5、1,12]，但在植物中其详细研究报道较少。目前，拟南芥、马铃薯、水稻等多种高等植物中也均有发现。Nakane等研究发现：在马铃薯中，该类蛋白参与抗病的过程，在防卫反应中参与马铃薯初级代谢和次级代谢的激活，但是到目前为止，其具体作用机制并不清楚[12]。..2材料与方法2.1材料本论文序列生物信息学分析和预测部分是在山西师范大学生命科学学院遗传准备室完成，实验验证部分是在山西师范大学生命科学学院遗传学实验室、遗传准备室、定温室和生物技术室完成的。马铃薯青枯病感、抗病栽培品种中薯3号和MS42.3由中国农业科学院蔬菜花卉所提

6、供。青枯菌（菌株PO463号生理小种，2号生化变种）由中国农业科学院植物保护所提供。种薯试管苗在定温室（昼26℃，夜20℃，光、暗12h交替）育苗，5至6叶龄移栽于含有泥炭土/蛭石为3︰1的营养土中，植株长至7至8叶时，接种青枯菌。接种方法参考何礼远伤根灌菌接种法[40]，进一步改进，接种青枯菌过程改良如下：取生长整齐健壮的7至8叶期植株，从营养钵的基部1至2cm端用刀片割破，暴露出根部，并将其立即浸入青枯菌菌液（菌浓度为108CFU/ml，即每升水中含108个青枯菌，时间为20min），接着套一新的营养钵，营养钵中加2

7、5ml菌液。接种后在定温室隔离继续光照培养，从第0.5、1、2、3、4、5天分别取其叶片，提取RNA作RT-PCR验证及qRT-PCR验证。TTC鉴定培养基（500ml）：葡萄糖5g，琼脂10g，牛肉膏2g，蛋白胨1.5g，L–酪氨酸0.5g，蒸馏水450ml，用1mol/ml的K2HPO4调pH至7.0至7.2，加蒸馏水定容至500ml，灭菌（121℃，25min）。使用前加5‰体积的无菌的氯化-2,3,5-三苯基四氮唑。扩繁培养基（500ml）：琼脂10g，牛肉膏2g，蛋白胨1.5g，酵母膏

8、0.25g，蒸馏水450ml，用1mol/ml的K2HPO4调pH至7.0至7.2，加蒸馏水定容至500ml，灭菌（121℃，25min）。2.2方法本论文研究的防卫相关基因是从实验室前期的抑制差减杂交技术（SSH）构建病原诱导后差异表达EST文库中筛选出来的[2]，运用生物信息学的方法对青枯菌诱导的全部序列进行初步