离体毛囊切片两种制作方法的比较及凋亡检测

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1、离体毛囊切片两种制作方法的比较及凋亡检测【关键词】体外培养摘要：目的对人头皮游离毛囊(HF)切片制作及凋亡检测方法进行比较。方法分别将石蜡切片法和冰冻切片法应用于游离毛囊；利用原位缺口末端标记法(TUNEL)进行荧光染色与3，3′二氨基联苯胺(DAB)染色,检测未经培养的游离毛囊及培养5d的游离毛囊的不同部位凋亡细胞情况。结果在对游离毛囊形态检测中，各组毛囊在外根鞘(ORS)，毛球(HB)下部，真皮鞘(DS)及毛乳头(DP)中的凋亡细胞数并无显著性差异(P>0.05)。结论冰冻切片法应用于游离毛囊简

2、单有效，TUNEL原位荧光结合DAB染色适合于检测毛囊细胞凋亡情况。　　关键词：毛囊；体外培养；凋亡　　parisonoftethodsofsectionmakinganddetectionofapoptosismethodonhumanscalphairfollicleinvitro　　ABSTRACT:ObjectiveToparetethodsofsectionmakingandtodetecttheapoptosisonhumanhairfollicle(HF)invitro.MethodsThe

3、paraffinsectionandfrozensectionmethodsinobenzidine(DAB)staining]akingfrozensectionoresimpleandfeasibleonsinglehairfollicle.Theapoptoticindexofouterrootsheath(ORS),loalsheath(DS)anddermalpapilla(DP)ofeverygroupshadnodifference(P>0.05).ConclusionThemetho

4、doffrozensectionorefeasibleonthesectionmakingofsinglehairfollicle.TheTUNELalcuttingtemperature,OCT)修出一平台，再用无损伤镊将毛囊以垂直刀口方向(毛球部朝向刀口)放在已修出的平台上，然后以OCT覆盖，冷冻10min后作4μm厚的冰冻切片，边切边在显微镜下观察，以便获得游离毛囊完整的中心纵剖面。　　1.3人头皮游离毛囊石蜡切片的制作选取形态好的游离毛囊，用Bouin固定液固定30min，乙醇脱色，15g/L琼脂

5、加热溶化并冷却到50℃时将组织放入浸泡,待琼脂完全凝固后，将内有毛囊的琼脂用刀片修成5mm3左右的长方形小块，再固定30min后，按梯度进行脱水，二甲苯透明，常规包埋，再以石蜡切片机修整后，调整角度，切成7μm左右的切片，HE染色。　　1.4原位细胞凋亡检测采用原位细胞凋亡检测试剂盒，DAB显色试剂盒(北京中山生物技术有限公司)，用原位荧光染色结合DAB染色进行分析，对毛囊Auber限界线下的毛球部、毛囊外根鞘细胞、毛囊真皮鞘及毛乳头细胞进行分析。计数各毛囊切片的不同部位的凋亡指数(阳性细胞数/细胞总数×

6、100%)。　　1.5统计学处理数据输入SPSS11.0进行分析，各组数据经KolmogorovSmirnov检验P>0.05，尚不能认为各组样本来自的总体不服从正态分布，且各组数据经Levene方差齐性检验P>0.05。故运用t检验进行分析。　　2结果　　2.1游离毛囊的基本结构特征冰冻切片形态：HE染色后在光学显微镜下可见毛皮质、内皮根鞘、外皮根鞘（ORS）及真皮鞘(DS)等清晰结构；各层间连续性较好，分离较少。整个毛球（HB）部边缘平整，结构清楚，核浆比例大，细胞形态清晰。毛乳头（DP）

7、边界清楚圆滑，呈梭形。内根鞘呈粉红色连续带状，紧贴于毛小皮。外根鞘细胞较多，核深染。真皮鞘中可见少量的成纤维细胞，与外根鞘分离较少。　　石蜡切片形态：可分辩出各层的大体结构，但各层之间有明显的分离，靠近毛干侧分离严重。整个毛球部边缘不规整，结构混乱，细胞形态不清晰。毛乳头边界不清。内皮根鞘不完整，中间有较多中断，且与毛小皮有明显的分离（图1）。外根鞘细胞层次少，与真皮鞘有非常明显的分离。真皮鞘呈条带状与其他结构完全分开。　　图1正常人头皮游离毛囊的形态（略）　　Fig.1Thestatusofnormal

8、humanscalphairfollicle　　a:frozensectionmethod;b:paraffinsectionHE10×10　　2.2凋亡状况的光镜观察结果在加入荧光素dUTP后，加入转化剂POD之前，在500-550nm波长荧光显微镜下可见到以蓝色荧光激发出的绿色荧光的阳性结果(图2a)；加入转化剂POD后DAB显色，苏木素复染后可见棕色的阳性细胞和蓝色的阴性细胞(图2b)。未经培养的生长期游离毛囊的凋亡情况