1 引言 柑桔溃疡病是由地毯草黄单胞杆菌柑桔致

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1、1引言柑桔溃疡病是由地毯草黄单胞杆菌柑桔致　　1引言　　柑桔溃疡病是由地毯草黄单胞杆菌柑桔致病变种(Xanthomonasaxonopodispv.citri)引起的一种国内外重大检疫性病害，给世界柑桔产业带来了巨大经济损失。病菌主要随罹病种苗等繁殖材料远距离传播，生产上常用的铜基杀菌剂和抗生素制剂对其防效不佳[1]，探索柑桔溃疡病的防治新途径在目前和将来都具有重大意义。基因工程重组单抗兼具治疗和诊断双重功能，利用抗原-抗体特异性结合原理，可用于人类疾病、植物病害的诊断、治疗和预防。　　近年来发展起来的噬菌体抗体库技术使人们可以绕开细胞杂交瘤技术，直接从基因水平制备特异性单链

2、抗体，由此开创了简便、快速生产基因工程抗体的先河，被认为是继杂交瘤技术后抗体生产技术的又一次革命[2,3]。20世纪80年代中期，Smith[4]等提出了噬菌体展示技术，到90年代初，13，再培养2h后，加卡那霉素至70μg/mL，37℃振荡过夜。次日离心收集上清,加PEG8000至4%、NaCl至3%,冰浴30min，4℃、9000r/min离心20min,弃上清,用2mL1%的BSA-PBS溶解沉淀,12000r/min离心5min,弃去不溶性沉淀,所得上清即为Fab噬菌体抗体库。　　2.2.5阳性克隆的菌落PCR鉴定及酶切鉴定　　分别挑取10个轻链库及Fab库阳性

3、克隆，经PCR初步鉴定后再分别用SacⅠ/XbaⅠ及SpeⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定其重组率。　　3.结果与分析　　3.1总RNA的提取　　对提取的总RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，其中总RNA电泳条带以28SrRNA和18SrRNA为主，用分光光度计测得总RNA的OD260/OD280的比值为1.8，浓度约为1μg/μL，显示总RNA质量好，无降解，符合试验的要求。　　3.2轻链和重链Fd段基因的扩增　　以cDNA第一链为模板，分别以轻链和重链Fd段基因的3′端引物和5′端引物进行PCR反应，分别扩增出轻链和Fd段。将PCR产物经1.5%的琼脂

4、糖凝胶电泳，显示在约680bp处可见明显的扩增条带(如图2)，与理论值相符。M为DNA分子量标准MarkerⅡ,1-7分别为轻链基因的PCR产物，8-10分别为重链基因的PCR产物。　　3.3轻链基因库的构建　　1μL轻链重组噬粒的转化细菌菌液铺板克隆数为1009个，测定转化效率为1106，通过菌落PCR法鉴定轻链重组质粒，电泳结果显示10个克隆在680bp处都有条带，均判定为阳性克隆，用SacI和XbaI对重组噬粒进行酶切反应再次验证，酶切后产物电泳发现10个克隆均有约4kb+680bp两个条带，判定为阳性克隆(如图3)，由此计算重组率约为100%。　　3.4噬菌体F

5、ab抗体库的构建　　1μL含抗体Fab片段基因的重组噬粒转化细菌菌液铺板有2006个克隆子，计算出转化率约为2106。随机挑取10个转化后的克隆子，通过菌落PCR法鉴定，其中有8个菌落扩增出680bp的片段，判定为阳性克隆，用XhoI和SpeI对重组噬粒进行酶切反应再次验证，酶切后产物电泳发现8个阳性克隆均切出4kb+680bp两个条带，判定为阳性克隆（如图4），由此计算重组率约为80%，库容量为1.6106。经过辅助噬菌体VCSM13的超感染，在PEG沉淀浓缩后，得到的上清即是噬菌体抗体库，测得噬菌体抗体库滴度为2.41011cfu。　　4讨论　　5结论　　本研究成功

6、构建了滴度为2.41011cfu的鼠源抗柑桔溃疡病菌噬菌体Fab抗体库，为进一步研究柑桔溃疡病的防治工作奠定了坚实的基础。中国网专业提供代写硕士服务，并提供大量硕士，如有业务需求请咨询网站客服人员!