产绿原酸金银花内生菌的分离研究论文

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1、摘要目的：通过对金银花不同组织器官内生真菌的分离，筛选能产生绿原酸的菌株，通过菌株的筛选及培养条件的优化，获得高产绿原酸的发酵菌株及培养基和培养条件。方法：从金银花不同组织器官中分离内生真菌，通过分离纯化、发酵，对其发酵产物进行TLC和HPLC分析，同时利用显微观察法对其进行显微鉴定，对筛选的高产绿原酸菌株的发酵培养基和培养条件进行优化选择，并对菌株发酵液进行抑菌学实验。结果：从金银花中分离筛选到三株纯化的的内生真菌，其浓缩发酵液与对照品有相同的迁移率，保留时间与对照品保留时间一致，结果表明，三株纯

2、化获得的内生真菌能产生绿原酸，分别属于青霉属、毛霉属、曲霉属。经过发酵条件的优化，确定最佳发酵培养基为PDB培养基，培养条件为28℃,120r/min，震荡培养72小时。结论：金银花不同器官中具有丰富的内生真菌，并有可能产生与宿主相同的活性成分绿原酸，纯化的产绿原酸菌株的发酵液具有明显的与金银花相同的抑菌效果。[关键词]：金银花；内生真菌；绿原酸；发酵缩写词表TLCthinlayerchromatography薄层色谱HPLChighperformanceliquidchromatography高效

3、液相色谱PDApotato-dextrose-agarmedium马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDBpotato-dextrosebroth马铃薯葡萄糖培养基目录1前言41.1内生菌与植物的关系41.2内生菌天然药物新资源及其展望52问题的提出63材料与方法73.1试剂73.2实验方法83.2.1菌株的筛选83.2.1.1实验材料的采集83.2.1.2样品的消毒处理93.2.1.3表面消毒效果的检测93.2.1.4分离与纯化93.2.1.5菌种的保藏103.2.2菌株次生代谢产物检测103.2.2.1菌株

4、的小样培养103.2.2.2内生菌发酵液的提取处理103.2.2.3薄层色谱法(TLC)检测绿原酸113.2.2.4高效液相色谱法(HPLC)检测绿原酸113.2.3内生真菌的形态学鉴定113.2.4二次发酵培养基的优化123.2.4.1固体基本培养基的选择123.2.4.2液体基本培养基的选择123.2.4.3发酵条件的单因素优化133.2.4.4发酵条件的正交试验133.2.5金银花内生真菌的抑菌实验144结果与分析154.1菌株筛选的结果154.2菌株次生代谢产物检测结果154.2.1薄层色谱

5、法(TLC)检测154.2.2高效液相色谱法(HPLC)检测164.3内生真菌的形态学鉴定结果194.3.1传统鉴定方法194.3.1.1菌株形态学描述194.3.1.2显微形态鉴定214.4二次发酵条件的优化结果254.4.1固体基本培养基的选择结果254.4.2液体基本培养基的选择254.4.3纯化分离出的菌株发酵液形态274.4.4发酵条件的单因素比较294.4.4.1碳源的选择304.4.4.2氮源的选择304.4.4.3温度的选择314.4.5发酵条件的正交试验324.5抑菌实验结果345

6、结论与讨论356展望36参考文献371前言1.1内生菌与植物的关系内生菌(endophyte)是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部，而不使宿主植物表现出明显感染症状的微生物。内生菌也可理解为植物组织内的正常菌群，它们与植物的关系相当密切，是植物微生态系统的天然组成成分。关于内生菌的起源仍然有不同的观点，存在两种假说，即“内生说”和“外生说”:内生说认为内生菌与宿主植物应该具有相同或相似的遗传背景；外生说认为内生菌源于植物体外，通过植物体表、根际的自然孔口、伤口或诱导植物形成的通道进入

7、体内。内生菌长期生活在植物体内的特殊环境中，植物以其内生菌的组织、细胞及其代谢产物为内环境，而内生菌以宿主植物的组织和细胞及其代谢产物为外环境，两者之间互相进行物质、能量及基因交流，在长期进化过程中与宿主协同进化，在演化过程中两者形成了互利共生的关系。一方面内生菌可从宿主中吸取营养供自己生长所需；另一方面，内生菌产生的次生代谢产物，能刺激植物的生长发育，提高宿主植物对非生物胁迫（如抗干旱）和生物胁迫（如抵抗病虫害等）的抵抗能力，内生菌与宿主植物在长期协同进化过程中彼此构成了和谐稳定的生态关系。另有观

8、点认为内生菌与宿主植物间存在基因交流，对红豆杉，长春花等药用植物内生菌的研究中，通过对其内生菌的发酵液进行化学分析，分离得到了和宿主植物相同或相似的生理活性成分，可见宿主植物与其内生真菌由于长期的共同生活因而关系非常密切。1.2内生菌天然药物新资源及其展望研究发现某些内生菌可以产生与宿主植物相同或类似的生理活性成分，这一发现可能在一定程度上解决了某些药物资源短缺的问题。近年来先后从红豆杉（Taxus），长春花等药用植物中分离得到了内生真菌，并从这些药用植物内生真菌发酵