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时间:2018-11-12
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1、生物化学实验醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白质一、实验目的掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法二、实验原理蛋白质是两性电解质。在pH值小于其等电点的溶液中,蛋白质为正离子,在电场中向阴极移动;在pH值大于其等电点的溶液中,蛋白质为负离子,在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质,它们所具有的可解离基团不同,在同一pH的溶液中,所带净电荷不同,故可利用电泳法将它们分离。血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等,各种蛋白质由于氨基酸祖坟、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同,在电场中迁移速度不同。由表可知,血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.
2、0,所以在pH8.6的缓冲液中,它们都电离成负离子,在电场中向阳极移动。蛋白质名称等电点相对分子质量白蛋白4.8869000α1-球蛋白5.06200000α2-球蛋白5.06300000β-球蛋白5.1290000~150000γ-球蛋白6.85~7.50156000~300000在一定范围内,蛋白质的含量与结合的燃染料量成正比,故可将蛋白质区带剪下,分别用0.4mol/LNaOH溶液浸洗下来,进行比色,测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描,测定其相对含量。肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使白蛋白下降。肾病时
3、α1、α2、β球蛋白升高,γ-球蛋白降低。肝硬化时α2、β-球蛋白降低,而α1、γ-球蛋白升高。三、实验器材1、醋酸纤维薄膜(2cm*8cm,厚度120μm)2、人血清;3、烧杯及培养皿数只;4、点样器;5、竹镊子;6、玻璃棒;7、电吹风;8、试管六只;9、恒温水浴锅;10、电泳槽;11、直流稳压电泳仪;12、7220型分光光度计;13、剪刀四、实验试剂1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液:取两个大烧杯,分别称取巴比妥钠和巴比妥溶解于500ml蒸馏水中;2、染色液,可反复使用;3、漂洗液:取乙醇45ml,冰醋酸10ml,混匀;4、浸出液:0.4mol/LNaOH溶液;5、透明液:取
4、冰醋酸25ml、无水乙醇75ml,混匀。五、实验操作1、准备和点样取一条醋酸纤维薄膜,浸入缓冲液中,完全浸透后,用镊子轻轻取出,将薄膜无光泽的一面向上,平放在干净滤纸上,再放一张干净滤纸吸取多余的缓冲液;用玻棒蘸取少量血清,涂在点样器上,然后轻轻于距纤维薄膜一端1.5cm处接触,样品即呈一条状突于纤维膜上。待血清透入膜内,将薄膜平贴于已放在电泳槽上、并已浸透缓冲液的纱布上,点样端为阴极;2、电泳接通电源,设定电泳电压为100V,通电50分钟;3、染色电泳完毕,将薄膜浸于染色液中10分钟,取出,用漂洗液漂至背景无色,再浸于蒸馏水中;4、定量将漂净的薄膜用滤纸吸干,剪下薄膜上
5、各条蛋白质色带,另取一条与各区带近似宽度的无蛋白附着的空白薄膜,分别浸于4.0ml0.4mol/LNaOH溶液中,37℃水浴10分钟,色泽浸出后,用7220型分光光度计在590nm处比色,以空白膜条洗出液为空白调零,测定各管的吸光度。5、透明另外取电泳好的薄膜,待其完全干燥后,浸入透明液中20分钟,取出,平贴于干净玻片上,干燥,即得背景透明的电泳图谱。六、实验数据记录蛋白质名称吸光度各组分比率%白蛋白0.50465.1α1-球蛋白0.0384.9α2-球蛋白0.0526.7β-球蛋白0.09712.5γ-球蛋白0.08310.8设各部分吸光率为:。则吸光度总合为:=+++
6、+=0.774白蛋白比率=/=0.651α1-球蛋白比率=/=0.049α2-球蛋白比率=/=0.067β-球蛋白比率=/=0.125γ-球蛋白比率=/=0.108七、实验讨论与总结1、什么是血清将抽取的血液置入不加抗凝剂的试管中,使血凝固,析出的上清液就是血清。血清中所含的蛋白成分与血浆相比,少了纤维蛋白原,而主要是白蛋白、球蛋白。2、由于蛋白的绝大部分均由肝脏合成,所以,各种蛋白质的质与量的变化,除与免疫性疾病等有关外,主要反映肝脏的生理、病理情况。3、醋酸纤维素薄膜醋酸纤维素(二乙酸纤维素)薄膜具有匀一的泡沫状结构,是由醋酸纤维素加工制成的。醋酸纤维素薄膜作为是电泳
7、支持体有以下优点:①电泳后区带界限清晰;②通电时间较短(二十分钟至一小时);③它对各种蛋白质(包括血清白蛋白,溶菌酶及核糖核酸酶)都几乎完全不吸附,因此无拖尾现象;④对染料也没有吸附,因此不结合的染料能完全洗掉,无样品处几乎完全无色。它的电渗作用虽高但很均一,不影响样品的分离效果,由于醋酸纤维素薄膜吸水量较低,因此必需在密闭的容器中进行电泳,并使用较低有电流避免蒸发。醋酸纤维素薄膜经1,4-二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透明,因而可得背景为无色的电泳图谱。4、血清提取蛋白从血清中提取的蛋白质,适用于食品工业的食品添加剂和医药
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