大鼠反流性食管炎和barrett食管基因表达谱的比较

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1、大鼠反流性食管炎和Barrett食管基因表达谱的比较作者：程鹏，龚均，刘贵生，汪涛，常英【摘要】目的:研究Barrett食管（BE）和反流性食管炎(RE)组织基因表达谱的差异.方法:建立胃十二指肠混合食管反流SD大鼠动物模型，用含有4096条双点大鼠cDNA芯片分别比较BE,RE和正常食管上皮（NC）mRNA表达情况.结果:芯片杂交差异表达在3倍以上的基因，RE和NC杂交芯片232项，其中表达上调的基因90条，表达下调的基因142条；BE和NC杂交芯片448项，其中表达上调的基因312条，表达下调的基因136条;相对于RE，BE表达上调的基因214条，表达下调的基

2、因86条.结论:BE和RE在基因表达水平上存在差异.【关键词】Barrett食管　　0引言　　近年来，食管腺癌（esophagealadenocarcinoma,EA）发病率在世界范围内呈增长趋势,Barrett食管被认为是其发生的重要危险因素备受关注.但其机制尚不清楚.我们应用Mi×0.2cm标本，40g/L甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察各种病变组织学特征.其余部分与组织切片建立一一对应关系，快速分离上皮组织并于离体10min内液氮冻存.根据病理结果将食管炎、Barretts食管组织分类存放，取对照组正常食管上皮作为对照（normalcontro

3、l,NC），保证每种组织纯度>80%，以备基因芯片检测.　　1.2方法cDNA芯片所用的4096个大鼠靶基因cDNA克隆由上海博星基因有限公司提供,以通用PCR引物扩增，PCR反应及产物纯化用标准方法进行，琼脂糖凝胶电泳监控PCR质量.靶基因溶解于3×SSC点样液中，用Cartesian7500点样仪点于硅烷化玻片上，每个靶基因重复2点.点样后玻片经2h水合，室温干燥0.5h，置于紫外交联仪中交联，再分别用2g/LSDS，水及2g/L硼氢化钠溶液处理10min，晾干备用.探针制备采用Chomczynski提出的一步法从上述组织中抽提总RNA,用Oligote

4、xmRNAMidiKit(qiagen)纯化mRNA,逆转录标记cDNA探针并纯化.参照Schena等（ProcNatlAcadSciUSA,1996，93:10614）的方法逆转录标记探针并纯化，用Cy5dUTP标记食管炎、Barrett食管组织样本cDNA,Cy3dTUP标记对照组食管组织作为对照cDNA.乙醇沉淀后溶解在20μL,5×SSC加2g/LSDS的杂交液中.将杂交探针和基因芯片分别在95℃水浴中变性5min,将探针加入基因芯片上,用盖玻片封片,置于60℃杂交15～17h.打开盖玻片,分别用2×SSC加2g/LSDS,0.1×SSC加2g/LSD

5、S的溶液洗涤10min,室温晾干.采用GeneralScanning公司的ScanArray3000扫描芯片,用预先选定的内参照基因Cy3和Cy5进行标准化处理，杂交结果显示：全部阳性对照信号清楚，阴性对照信号很弱，证明实验数据可靠.用GenePixPro3.0软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的比值,用40个持家基因进行Cy3和Cy5的均衡，并对Cy3进行标准化处理得出Cy3*，计算Cy5/Cy3*两者的比值用于异常表达判断.判定基因差异表达的标准定为:①Cy5和Cy3*的比值ratio大于3.0或小于0.33;②有效基因的Cy3*和Cy5的值两者皆大于200或

6、其一大于800；③PCR结果良好.　　2结果　　2.1基因芯片杂交信号散点图NC,BE,RE组织总RNA的A260/A280值为2~2.6，电泳结果证实，抽提到高纯度总RNA.差异表达基因筛选,以Cy3与Cy5的荧光信号值作散点图，X轴、Y轴分别以Cy3荧光信号值（=前景值-背景值）和Cy5的荧光信号值为坐标，每一数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号，显示一个很分散的分布图形，大部分聚集在几乎为45度的对角线周围的红点代表Y值和X值的比值在0.33至3.0之间，属于非差异性表达；数据点为黄色，代表Y值和X值的比值在0.33至3.0之外，属于差异性表达.　　2.2基

7、因芯片杂交荧光扫描图基因芯片杂交差异表达显著性在3倍以上的的基因，其中RE和NC杂交芯片232项，其中表达上调的基因90条，表达下调的基因142条；BE和NC杂交芯片448项，其中表达上调的基因312条，表达下调的基因136条.BE,RE与NC比较所有差异性表达的基因去除BE,RE共同差异性表达的基因为BE与RE比较差异性表达的基因，共300条，上调表达的基因214条，表达下调的基因86条,这些基因按功能分成12大类.BE与RE比较表达差异3倍以上的部分基因(表1，2).　　表1BE与RE表达差异3倍的基因功能分类　略　　表2BE与RE比较表达差异3倍以上的部分基

8、因　略