tlr4在肝癌细胞株hepg2的表达

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1、TLR4在肝癌细胞株HepG2的表达【摘要】　　目的：研究肝癌细胞株HepG2是否有TLR4的表达。方法：采用RTRCR和RNA和蛋白在HepG2细胞的表达情况。结果：HepG2中检测有ＴＬＲ４　ｍＲＮＡ和蛋白的表达。结论：HepG2细胞表面有ＴＬＲ４的表达。【关键词】ＴＬＲ４；肝细胞癌；HepG2　　Ｔｏｌｌ样受体（ｔｏｌｌｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＴＬＲ）是炎症信号传递的门户蛋白，在免疫防御反应中起重要作用。ＴＬＲ４（Ｔｏｌｌｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　４，　ＴＬＲ４）是第一个发现的哺乳动物的Ｔｏｌｌ样受体，ＴＬＲ４主要表达

2、在淋巴样组织（如脾）　和外周血白细胞如单核巨噬细胞、树突状细胞、小部分的表皮细胞系以及Ｔ、Ｂ　淋巴细胞系上［１］。研究表明ＴＬＲ４不仅表达在免疫系统相关的细胞中，在一些组织细胞中也有表达，特别是和外界环境相对接触较多的上皮细胞，如胃、肠、肺、牙龈、肾的上皮细胞、肝等［２～４］，研究者还发现许多来源不同组织的肿瘤细胞表面都表达ＴＬＲ４，这可能与肿瘤的免疫微环境的建立与维持有关［５～７］。如胃癌的细胞表面有ＴＬＲ４的表达，而ＴＬＲ４的表达使胃癌细胞可以与幽门螺杆菌相互作用而诱导产生促胃癌细胞生长的因子［８］。研究显示ＴＬＲ４在一些肝脏疾病如病

3、毒型肝炎、肝硬化、肝纤维化、酒精性肝病等的发生及发展机制中亦有重要作用［９］。本实验利用ＲＴＲＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ方法从基因和蛋白两个角度来检测肝癌细胞株HepG2是否有ＴＬＲ４的表达，这将为今后对ＴＬＲ４的研究奠定基础。　　１实验材料与方法　　１.１实验材料HepG2细胞株（中国医科大学肿瘤研究所第一研究室）；兔抗人ＴＬＲ４一抗（博士德生物技术有限公司）；鼠抗βａｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ公司）；碱性磷酸酶羊抗兔二抗（北京中山生物技术有限公司）；ＰＣＲ引物（大连宝生物公司）；ＤＮＡ分子量标准（大连宝生物公司）；ＲＴＰＣＲ试剂盒

4、（大连宝生物公司）。　　１.２实验方法　　１.２.１细胞培养HepG2肝癌细胞株在含１０％胎牛血清的（ＦＢＳ）的ＲＰＭＩ１６４０培养基中常规培养，　９５％湿度，５％　ＣＯ２，３７℃。每２～３　ｄ换培养基一次，每周传代１次。选生长状态好，处于对数生长期的细胞进行试验。结束培养时，细胞以０.１２５％胰酶消化，４℃离心机离心２次（１　５００ｒ／ｍｉｎ），－７０℃低温冰箱保存待检。　　１.２.２Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ取１ⅹ１０７细胞加入１　ｍｌ细胞裂解缓冲液［１００　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７.５），１００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钠，０.

5、５％脱氧胆酸钠，１　ｍｍｏｌ／Ｌ已二胺四乙酸（ＥＤＴＡ），１％ＮＰ４０，０.１％十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）和蛋白酶抑制剂］，提取细胞的总蛋白并经Ｌａｒｒｙ法定量，取５０μｇ蛋白上样到１５％的ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶，电泳（１００　Ｖ，１.５　ｈ）。待溴酚蓝进入凝胶底部后，把蛋白质再印迹到硝酸纤维素膜上，用抗Ｌｉｖｉｎ抗体和抗βａｃｔｉｎ抗体孵育，最后加入用碱性磷酸酶（ＡＰ）标记的相应二抗，用ｏＤｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ，Ｔｅｔｒａｚｏｔｉｚｅｄ和βＮａｐｈｔｈｙｌ　Ａｃｉｄ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ显色剂进行显色后用凝胶成像仪分析图像。　　１.２

6、.３ＲＴＰＣＲ采用Ｔｒｉｚｏｌ试剂一步法提取组织总ＲＮＡ，紫外分光光度计测定纯度并定量。根据ＧｅｎＢａｎｋ提供的ＴＬＲ４和内参照βａｃｔｉｎ的ｍＲＮＡ序列，应用软件Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ５.０自行设计引物。引物序列如表１。　　表１ＴＬＲ４和βａｃｔｉｎ引物序列（略）　　反应条件：９４℃　５　ｍｉｎ，１个循环；９４℃　３０　ｓ，５９℃　３０　ｓ，７２℃　１　ｍｉｎ，３５个循环；７２℃　５　ｍｉｎ后结束扩增反应。取５　μｌ　ＰＣＲ产物与２　μｌ　Ｌｏｄｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ混合，进行１.５％琼脂糖凝胶电泳，１００Ｖ　１.５　ｈ，电

7、泳结束后，凝胶成像仪成像分析。　　２实验结果　　ＲＴＰＣＲ的结果如图１Ａ所示：在肝癌细胞株ＨｅｐＧ２中存在ＴＬＲ４基因的转录。如图１Ｂ所示：在肝癌细胞株ＨｅｐＧ２中存在ＴＬＲ４蛋白的表达。　　图１ＴＬＲ４　ｍＲＮＡ和蛋白在ＨｅｐＧ２中的表达（略）　　３讨论　　ＴＬＲ４是新近发现的天然免疫受体，做为Ⅰ型跨膜蛋白，最基本的功能是信号的跨膜转导。最初人们认为ＴＬＲ４主要表达于免疫细胞尤其是巨噬细胞和树突状细胞表面，它们可以通过广泛地特异性地识别病原体相关的分子模式（　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐａｔ

8、ｔｅｒｎｓ，ＰＡＭＰｓ），偶联信号转导途径，并激活天然免疫细胞，最终导致一系列的免疫炎症反应［１０，１１］。ＴＬＲ４还能识别在应激、损伤和细胞非凋亡性死亡等情况下机体内产生的一些内源性分子，触