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1、C基因型HBV转基因小鼠的制备作者：尤玉琴，黄黎珍，刘光泽，佟明华，李秀梅，胡莲美，顾为望，孔祥平【摘要】 目的：建立C型HBV转基因小鼠，为乙肝防治研究提供实验动物模型.方法：采用受精卵显微注射法，制备HBV转基因小鼠，用PCR，ELISA,荧光定量PCR和免疫组化的方法研究HBV基因在转基因小鼠体内的整合、复制和表达情况.结果：注射受精卵2840枚，筛选注射后成活的受精卵共2256枚，注射成活率79.4％.注射后受精卵共移植假孕雌鼠85只，其中有42只怀孕，假孕雌鼠妊娠率49％，共产下F0代小鼠168只，PCR检测共有14只小鼠阳性，其中ELISA检测血清HB
2、sAg阳性5只,HBeAg均阴性.荧光定量PCR血清HBVDNA显示，2只小鼠的拷贝数分别为3.12×105copies/L,1.98×105copies/L，经传代产下F1代小鼠61只，PCR检测HBVDNA阳性5只，ELISA检测HBsAg阳性4只，其中肝脏HBsAg免疫组化阳性2只，HBcAg均阴性，且肝组织表达HBsAg为胞浆型.结论：构建的C型HBV基因不但可以在转基因小鼠体内进行复制表达，而且可以遗传给下一代小鼠.【关键词】肝炎病毒乙型小鼠转基因肝炎表面抗原乙型肝炎核心抗原乙型血清DNA 【Abstract】AIM：TogenerateHBV(C)ge
3、nometransgenicmicetoprovidesuitableanimalmodelsfortherelatedresearchesinChina.METHODS：TheHBVtransgenicmiceicroinjectionof1.3copiesHBVgenomeintothepronucleusofFVB/Nzygotes.ThePCRassay,ELISA,RT-PCRandimmunohistochemicalmethodsice.RESULTS：Inthisstudy,2840zygotesicroinjectionplantedintothe
4、oviductsof85psudopregnantKMfemalemice.Afterbirth,42femalemicee.雌性小鼠体质量20～22g，6～8aI位点，用限制性内切酶酶切质粒pHBV(C)1.3，10g/L琼脂糖凝胶电泳回收大小约为4.1kb的条带，即为目的转基因片段HBV(C)1.3，纯化后溶于TE备用. 1.2.2显微注射法制备1.3copyC型HBV转基因小鼠选4～5areserumgonadotropin,PMSG）5U，ip，48h后注射人绒毛膜促性腺激素（humanchorionicgonadotropin,HCG）5U，激素超排处理
5、后与FVB/N公鼠1∶1合笼，次日清晨检阴栓阳性为显微注射用受精卵供体鼠.将结扎KM公鼠与正常KM母鼠合笼，选取有阴栓且阴门肿胀、红润的母鼠做为注射后受精卵移植的受体鼠.将HBV(C)1.3DNA溶液利用原核显微注射的方法直接注入超排得到的FVB/N单细胞受精卵的原核内，取注射存活的受精卵移植到假孕KM母鼠的输卵管内.待其怀孕产仔后，进行检测. 1.2.3转基因小鼠HBV基因整合及复制表达检测取小鼠尾组织基因组DNA进行PCR检测，反应体系50μL按94℃，30s；55℃，30s；72℃，45s共35个循环.取产物10μL进行琼脂糖电泳，做PCR分析.对PCR阳性
6、鼠，在眼眶后静脉丛采血300μL，37℃放置2h，3000r/min离心6min，取上清.ELISA检测HBsAg/HBeAg，定量检测HBVDNA，使用实时荧光PCR仪进行结果分析.取小鼠肝脏，置40g/L中性甲醛中，4℃固定12～14h.按常规方法制作组织切片，进行免疫组化分析.HBsAg抗体1∶500稀释，HBcAg抗体1∶500稀释. 2结果 2.1目的基因的整合（F0代）共注射受精卵2840枚，筛选注射后成活的受精卵共2256枚，注射成活率79.4％.注射后受精卵共移植假孕雌鼠85只，其中有42只怀孕，假孕雌鼠妊娠率49％，共产下F0代小鼠168只，P
7、CR检测共有14只整合阳性（A3,A48,A51,A53,A55,A56,A57,A62,A69,A74,A81,A82,M66,M90）（8.3％），携带有外源目的基因，PCR产物电泳后在500bp处有一条带，为阳性小鼠(图1). 1:阳性对照;2:阴性对照. 图1F0代转基因小鼠基因组DNAPCR检测结果（略） 2.2目的基因的体内复制和表达对PCR检测HBVDNA阳性小鼠血清进行HBsAgELISA检测，HBsAg阳性鼠有：A56，A69，A74，A81，A82，其中A56和A69呈较弱阳性.HBeAg检测均为阴性.同时，PCR检测HBVDNA阳性小
