微生物快速鉴定技术的发展和应用

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1、微生物快速鉴定技术的发展和应用池王胄(上海新先锋药业有限公司上海浦东201203)【中图分类号】R927【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2012)12-0053-02传统的微生物的检测、鉴定方法仍停留在分离培养形态观察、生化鉴定和血清学分型水平上，虽然其准确性较高，但涉及的实验繁多，操作烦琐、检测耗时长、检测周期长、准备与收尾工作较繁重，且需要大量工作人员参与，而且对难以培养的病原菌的检测，难度较大，检测结果存在不同程度的滞后性。因此，对微生物进行准确、灵敏、省时、省力和省成木的快速检验方法已经成为当今微牛.物检测的迫切需求。目前，一些简便敏感及时的检测新思路，新方法得到

2、改进和开发，木文主要对生物化学方法，免疫检测技术，快速测试片法，选择鉴定用培养基法，免疫检测技术，细菌直接计数法、全自动微生物分析系统等方法的研究进展作一综述。1分子生物学技术1.1PCRPCR检测技术是在体外利用耐热DNA聚合酶作用合成特异性DNA片段，通过变性-延伸-复性的循环操作，将DNA模板迅速扩增数百万倍后,再通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增DNA产物的荧光条带，以确定微牛.物的特定种类的技术。其其有高度的敏感性和特异性，理论上可以检出一个细菌的拷贝基因，因此，在检测中大大缩短了增菌的时间。另外PCR技术在16S-23S区间序列的扩增也可以用于16S不能鉴别、非常接近的菌种和种内细菌

3、之间的鉴别。而荧光定量PCR技术改变了PCR定量较差的缺点，对李氏杆菌、大肠杆菌、肉毒杆菌、沙门杆菌等病原菌能有效的定量检查［1］。PCR检测受检测物成分、增菌培养基成分、扩增过程操作等影响，某些微生物DNA对Taq酶只有抑制作用也可能导致检验结果出现假阴性或假阴性；其操作过程要求严格，微量的外源性DNA进入PCR后产生假阳性结果。而且，它仅限于核酸序列己知的微生物的鉴定，不能区分活细胞和死细胞，一次只能对一种病原菌进行检测，对不同的样本检测不同的病原菌，就需要多次检测，效率低，周期长。荧光定量PCR技术，虽然较为准确，但成本较高，对不同的病原菌需要合成不同的荧光标记的探针，价格昂贵，不

4、易在基层开展。1.2基因探针技术DNA探针技术又称分子杂交技术，是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，对某一特异性DNA序列进行探查的新技术。其利用具有同源性序列的核酸单链在适当条件下互补形成稳定的DNA-RNA或DNA-DNA链的原理，采用高度特异基因片段制备基因探针来识别细菌。探针需要附加适当的标记，如放射性同位素、酶或者发光的标识物。与传统方法相比基因探针技术具有快速、灵敏的特点，减少了基因片段长度多态性所需要分析的条带数。据报道，能从It水中检测出10个病毒来，精确度大大提高［2］。但是该方法每检测一种菌就需要制备一种探针，对尚未建立的菌种以及0标菌以外的其他

5、菌不能鉴定，还有待进一步发展。1.3基因芯片技术基因芯片是采用微加工和微电子技术将数以万计、乃至百万计的基因寡核苷酸有序地、高密度地排列在硅片、玻片或纤维膜等载体上而得到的一种信息检测芯片。微生物样品DNA经PCR扩增后制备荧光标记探针，再与芯片上寡核苷酸点杂交,最后通过扫描仪定量并分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物。微生物样品DNA经PCR扩增后制备荧光标记探针，然后再与芯片上寡核苷酸点杂交，通用落射荧光显微镜或其它荧光显微装置对片基进行扫描，采集每点荧光强度并对其进行分析比较，从而来确定检测样品是否存在某些特定微生物。基因芯片技术由于同吋将大量探针固定于支持物上，所

6、以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，理论上，基因芯片可以在一次实验中检出所有潜在的致病原，从而解决了传•统核酸印迹杂交（SouthernBlotting和NorthernBlotting等）技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足，具有简便快速、特异性强、可并行检测等诸多优点。然而，基因芯片技术虽然有很好的发展前景，芯片制作、样品采集、处理技术等方面也冇了长足的发展。但是其依然存在技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度相对较低、重复性差、分析泛围较狭窄等问题。在这些方面仍然有待改进［3］。2免疫学技术免疫学技术通过抗原和抗体的特异性结合反应，再辅以免疫放大技术来鉴别细菌

7、。由于免疫检测技术具备高度的灵敏度，样品经增菌后可在较短的吋间内达到检出度样品，在进行选择性增菌后，抗原和抗体的结合反应可在很短吋间内完成达到检出度，不需分离，即可采用免疫技术进行筛选。由于其效果较好，对技术要求也不十分的高，0前在基层单位应用较为广泛。2.1乳胶凝集反应乳胶凝集反应是人工大分子乳胶颗粒标记抗体与待测抗原发生内眼可见的凝集反应，以达到检测目标病原微生物或毒素的0的。如AureusTest试剂盒中含有抗金黄色葡萄球菌A