何首乌饮对衰老大鼠肾脏增殖与凋亡的影响

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1、何首乌饮对衰老大鼠肾脏增殖与凋亡的影响作者：陈雪牛嗣云曲银娥李亚丽高福禄【摘要】目的研究中药何首乌饮对衰老大鼠肾脏增殖及凋亡的影响。方法50只SD大鼠随机分为5组：阴性对照组，模型组，何首乌饮高、中、低剂量组，每组10只。D-半乳糖连续腹腔注射制作亚急性衰老大鼠模型。采用SP免疫组化法和原位末端标记法(TUNEL法)分别检测肾脏组织PA和凋亡的表达情况。结果①模型组大鼠肾脏PA阳性细胞数低于阴性对照组大鼠(P<0.05)。何首乌饮各剂量组PA阳性细胞数高于模型组(P<0.05)。②模型组大鼠肾脏TUNEL阳性细胞数高于阴性对照组大鼠(P<0.

2、05)。何首乌饮各剂量组TUNEL阳性细胞数均低于模型组(P<0.05)。结论何首乌饮可明显提高衰老大鼠肾脏的增殖能力并抑制其凋亡，具有一定的延缓衰老作用。【关键词】何首乌饮衰老肾脏增殖细胞核抗原细胞凋亡研究发现在组织器官发育、完善的过程中细胞增殖不但总是与细胞凋亡相伴随［1］，而且机体的衰老过程与两者的关系亦密不可分。本实验应用免疫组织化学技术和原位末端标记法(TUNEL)分别检测肾脏PA阳性细胞和凋亡细胞在D-半乳糖致亚急性衰老模型大鼠肾脏的表达情况，阐明何首乌饮对衰老肾脏的影响，为研究衰老机制及开发临床抗衰老药物提供理论依据。　　1材料与方法　　1

3、.1药品、试剂和实验动物何首乌饮方剂购自承德市肛肠医院；D-半乳糖购于北京化学试剂公司；PA购自中杉金桥生物试剂公司；TUNEL试剂盒购自Roche生物试剂公司。清洁级8周龄雄性SD大鼠，体重180～220g，购自河北医科大学实验动物学部，动物合格证号：605106。　　1.2何首乌饮药物溶液的制备何首乌饮方剂组成:何首乌（炙）、肉苁蓉、怀牛膝、淫羊藿、丹参、茯苓按质量比3∶2∶3∶2∶5∶3比例混合，水浸泡1h，然后水煎2次，30min/次，过滤后浓缩至含生药分别为0.75，1.5，3.0g·ml-1（分别作为低、中、高剂量药液）。4℃保存，给药前复温至25

4、～30℃。　　1.3造模及实验分组50只SD大鼠随机分成阴性对照组、模型组、何首乌饮低、中、高剂量组（10，20，40g·kg-1·d-1），每组10只。阴性对照组腹腔注射等体积生理盐水，其余4组大鼠腹腔注射D-半乳糖300mg·kg-1(用生理盐水配制成6%的溶液)，连续60d，制备亚急性衰老大鼠模型［2］。给药组在造模第1日起同时每天一次灌胃何首乌饮，连续60d；阴性对照组和模型组灌胃等体积的生理盐水。　　1.4检测方法　　1.4.1采用免疫组织化学S-P法按照免疫组化常规步骤操作。石蜡切片的抗原修复采用pH6.0的柠檬酸抗原修复液，加热至沸腾后5min缓

5、慢冷却；PA(抗体稀释比1∶200)4℃过夜。以PBS替代一抗作为阴性对照。　　1.4.2原位末端标记法(TUNEL染色法)将切片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上，切片常规脱蜡至水，各步骤按TUNEL试剂盒操作，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。以不含末端脱氧核苷酸转移酶的液体代替TUNEL混合液作阴性对照。　　1.4.3结果判定PA及TUNEL染色标本细胞胞核染成棕黄色粗颗粒为阳性反应细胞。在显微镜(400×)下，每张切片上随机选取10个视野，计数阳性细胞，每组计数3只动物，每个标本计数3张切片，计算每个视野的平均阳性细胞数。　　1.4.4数据处理E

6、xcel建立数据库，SPSS13.0软件分析，单因素方差分析比较组间差异。　　2结果　　2.1免疫组化染色结果各组切片均可见PA染色，免疫阳性产物位于细胞核，通常呈棕黄色颗粒状，小部分呈弥散状。免疫阳性细胞主要分布于肾小管，肾小球有少量表达。模型组大鼠肾脏PA阳性细胞数低于阴性对照组大鼠，何首乌饮各剂量组PA阳性细胞数高于模型组，差异均有统计学意义。见表1。　　2.2TUNEL染色结果TUNEL阳性细胞主要表达在肾小管上皮细胞，肾小球仅有少量表达。模型组大鼠中凋亡细胞成簇存在，而在用药组散在分布。模型组大鼠肾脏TUNEL阳性细胞数高于阴性对照组，何首乌饮各剂量

7、组TUNEL阳性细胞数均低于模型组，差异均有统计学意义。见表1。　　表1各组大鼠肾脏PA和TUNEL结果比较（略）　　与阴性对照组比较，▼P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05；n=9　　2.3PA和TUNEL的相互关系经相关分析PA和TUNEL具有负相关关系（r=-0.912，P=0.000）。　　3讨论　　近年来延缓衰老以及老年病的预防已成为国内外研究的焦点，寻找有效的抗衰老药物是衰老研究中的一个重要方面。由于化学药物的广泛使用及其毒副作用，研究的方向已瞩目于传统中药。何首乌饮由何首乌（炙）、肉苁蓉、怀牛膝、淫羊藿、丹参、茯苓组成。何首乌、

8、肉苁蓉、怀牛膝能填精补髓、乌发延年，淫