枸杞多糖对实验性食管癌大鼠外周血细胞免疫功能的影响

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1、枸杞多糖对实验性食管癌大鼠外周血细胞免疫功能的影响作者：单铁英，乔俊红，杨书良，苏安英，唐军民【摘要】目的探讨枸杞多糖对甲基苄基亚硝胺诱导食管癌大鼠外周血细胞免疫功能的影响及其意义。方法健康雄性F344大鼠40只，随机分为模型组(10只)、治疗组(10只)、生理盐水对照组(10只)和正常对照组(10只)。正常对照组常规饲养，其余两组以甲基苄基亚硝胺(NMBA)0.5mg/kg皮下注射于大鼠诱导食管癌模型，治疗组在诱癌同时预防性给予枸杞多糖10mg/kg灌胃治疗，生理盐水对照组给予生理盐水1ml/kg灌胃。在诱癌9周、15周每组分别取5只大鼠抽取外周血，EDTA抗凝,用流式细胞仪检测

2、大鼠外周血中CD4+T细胞和CD4+CD25+调节性T细胞(Tr细胞)的细胞数，另留取血清ELISA法检测大鼠外周血IL-10的含量。结果甲基苄基亚硝胺诱导大鼠食管癌后大鼠外周血中CD4+T细胞比例显著下降，CD4+CD25+Tr细胞比例显著升高;此过程随诱癌时间而加重，各时间点与对照组比较差异均有显著性(P均<0.05);用药后9周、15周枸杞多糖治疗组CD4+CD25+Tr细胞占淋巴细胞百分比显著低于模型组(P<0.05)，CD4+T细胞比例显著高于模型组(P<0.05);模型组大鼠血清IL-10水平显著高于正常对照组，经枸杞多糖治疗后显著下降。结论甲基苄基亚

3、硝胺诱导大鼠食管癌后外周血中CD4+CD25+Tr细胞表达增强，IL-10分泌显著增加，枸杞多糖可有效抑制其表达，显著改善实验性食管癌大鼠细胞免疫功能障碍。【关键词】甲基苄基亚硝胺;枸杞多糖;食管癌;流式细胞术;T细胞我国食管癌的发病率目前居世界第一位，因此研究食管癌发生发展的机制以及寻找治疗食管癌的有效措施是当前急需攻克的重大难题。已有的研究显示肿瘤免疫逃逸是肿瘤发生发展的重要机制，而越来越多的证据表明CD4+CD25+调节性T细胞(RegulatoryTcell,Tr)可能在肿瘤免疫逃逸中起了关键作用[1，2]。本课题组在中药枸杞多糖抗肿瘤的研究过程中,发现枸杞多糖(lyciu

4、mbararumpolysaccharides，LBP)在体外可刺激人外周血DC(树突状细胞)分化成熟、增加DC细胞产生IL-12和TNF-α等免疫功能[3]，而其在体内对肿瘤免疫的作用尚未见报道。因此本研究中我们以甲基苄基亚硝胺(N-nitrosomethylbenzylamine,NMBA)诱导大鼠食管癌实验动物模型为基础，观察了CD4+CD25+调节性T细胞在食管癌形成过程中的变化，并观察了枸杞多糖对其调节作用，从而为枸杞多糖的开发利用提供实验依据。　　1材料与仪器　　甲基苄基亚硝胺(NMBA)，纯度>98%，购自日本NARDCo.Ltd(Osaka,Japan)公司,

5、使用时用生理盐水配制。枸杞多糖由本校实验中心从宁夏优质枸杞子中分离提取，纯度超过99%，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的小鼠抗大鼠CD4单克隆抗体(单抗)，藻红蛋白(PE)标记的小鼠抗大鼠CD25单抗均购自美国BD公司产品。EpicsXL型流式细胞仪(美国Coulter公司)。40只健康雄性F344大鼠，5～6周龄，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供[合格证号:SCXX(沪)20070005]。　　2方法　　2.1食管癌动物模型制备及分组大鼠适应环境2周，被随机分为模型组、治疗组、生理盐水对照组和正常对照组，每组10只。正常对照组大鼠常规饲养，生理盐水对照组给予生理盐水1ml/k

6、g灌胃，模型组大鼠仅皮下注射0.5mg/kgNMBA，治疗组大鼠同时给予NMBA0.5mg/kg皮下注射及LBP10mg/kg灌胃。给药方案：3次/周，共5周。　　2.2大鼠外周血CD4+及CD4+CD25+T细胞的表达应用荧光直接标记法及流式细胞仪检测外周血CD4+及CD4+CD25+T细胞水平。取不同荧光标记的单克隆抗体各10μl，分别加入100μlEDTA抗凝的全血，室温下孵育15min，加入红细胞裂解液，PBS洗涤2次，用流式细胞仪检测。测定5000个细胞，记录CD4+T细胞和CD4+CD25+Tr细胞分别占淋巴细胞的百分比。Cellquest软件分析数据。　　2.3大鼠外

7、周血IL-10的检测收集各组大鼠外周血，离心取血清，ELISA法检测血清IL-10水平。严格按试剂盒说明书操作。　　2.4统计学处理所有检测数据以±s表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。　　3结果　　3.1LBP对实验性食管癌大鼠外周血调节性T细胞的影响与正常对照组相比，NMBA诱癌9周时，模型组外周血中CD4+T细胞比例显著降低，CD4+CD25+Tr细胞比例显著升高，此过程随诱癌时间而加重。LBP治疗组诱癌9周