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《GB-T19200-2003 猪水泡病诊断技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、ICs11.220B41中华人民共和国国家标准GB/T19200-2003猪水泡病诊断技术Diagnostictechniquesforswinevesiculardisease2003-06-17发布2003-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局GB/T19200-2003月组舀猪水泡病(SwineVesicularDisease，简称SVD)是猪的一种烈性传染病，被世界动物卫生组织[WorldOrganizationforAnimalHealth(英),OfficeInternationaldesEpizooties(法)，OIE]列为A类疾病，我国
2、将其列为一类动物疫病。本病主要在猪的蹄踵、蹄冠、唇、舌、鼻及乳头部引起水泡，临床症状与猪口蹄疫(FootandMouthDisease，简称FMD)相似。本标准提出的实验室方法主要是以世界动物卫生组织(OIE)K哺乳动物、禽、蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册》为依据，并结合我国实际情况制定，其中“猪水泡病反向间接血凝试验”是我国建立的方法。本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E均为规范性附录。附录F为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国农业科学院兰州兽医研究所。本标准主要起草人:张永光、牟
3、克斌、王永录、刘西兰、方玉珍。GB/T19200-2003猪水泡病诊断技术范围本标准规定了猪水泡病病毒分离及鉴定，反向间接血凝试验(RIHA)、琼脂凝胶免疫扩散试验(AGID)和病毒中和试验(VN)的技术要求。本标准适用于猪水泡病的诊断。反向间接血凝试验和琼脂凝胶免疫扩散试验适用于大批样品筛选试验，包括产地检疫、疫情监测、流行病学调查和无本病健康猪群的建立;病毒中和试验(VN)适用于诊断和进出口猪检疫及抗体水平的评估。2病毒分离及鉴定2.1材料准备2.1.1灭菌注射器，研钵。2.1.2pH7.6,0.05mol/L的磷酸缓冲液(PB),pH7.6,50%的丙三醉磷酸缓冲液(
4、GPB),pH7.2,。.11mol/L的磷酸缓冲液(PB)，配制方法见附录A,2.1.3仔猪肾传代细胞(IB-RS-2)，乳鼠。2.1.4细胞培养液，见附录B,2.2样品的采集及处理2.2.1水泡液:将水泡表面用75%酒精棉球消毒，用注射器抽取水泡液，直接放人灭菌小瓶中，加盖封口，避光送至实验室，不做处理直接用于检测。2.2.2水泡皮:采集鼻镜、蹄部新鲜水泡皮，采集量为0.5g以上，放人预先加有pH7.6,50%的GPB的灭菌瓶中，加盖封口，送至实验室。2.3细胞分离2.3.1新鲜水泡液不做任何处理，可直接使用。当IB-RS-2长满单层细胞后，弃去培养液，加人水泡液，以能
5、淹没细胞单层为宜，于370C感作30min，然后补加4倍于水泡液的细胞培养液，置370C培养。每天在倒置显微镜下观察2次，48h终判，若细胞培养液对照孔成立，分离病毒的细胞孔细胞出现变圆乃至脱落，则视为细胞病变(CPE)判为阳性，若48h不出现CPE，则应冻融2次，再育传3代，不出现CPE，判为阴性，出现CPE，则需做进一步鉴定。2.3.2水泡皮的分离，将水泡皮用pH7.2,0.11mol/LPB洗2次一3次，用灭菌滤纸吸去水分，称其质量后置于加少量石英砂或玻璃砂的研钵中，按质量体积比(1:2)一(1:5)加人pH7.2,0.11mol/I.PB研磨，制成悬液，室温浸毒Ih
6、或4'C12h，以3000r/min离心20min-30min，取上清液用于病毒分离。2.4乳鼠分离2.4.1乳鼠为2-3日龄小鼠，每份材料接种4只小鼠，每只顶背部皮下接种。.1mI,-O.2mL，在母鼠哺乳下观察5天。2.4.2若5天内出现神经症状乃至死亡，剥皮去头及内脏，将肌肉及骨胳一起称量，按质量体积比加9倍的细胞培养液，加玻璃砂研磨制成悬液，置40C浸毒过夜.以1000r/min离心10min，取上清液用于进一步鉴定。2.5反向间接血凝试验(RIHA)鉴定分离物GB/T19200-20032.5.1材料准备2.5.1.196孔V型聚乙烯血凝滴定板(110度)，微量振
7、荡器或微型混合器，0.025m1_0.05mI_稀释用滴管、乳胶吸头或25pL,50川一移液加样器2.5.1.2稀释液I、稀释液l，配制方法见附录C2.5.1.3标准抗原、标准阳性血清2.5.1.4敏化红细胞诊断液，效价滴定见附录Do2.5.2操作方法2.5.2.1使用标准抗原进行猪水泡病与口蹄疫A,O,C,Asia-I型鉴别诊断。2.5.2.1.，被检样品的稀释:把8支试管排列于试管架上，自第1管开始，每管加。.5ml稀释液I,第一管加。.5ml被检样品，由左至右做二倍连续稀释(即1，6,1，12,1，24...
