负载htert复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定

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1、负载hTERT复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定作者：陈陵，向国春，李向红，蔡永国，李晶晶，房殿春，罗元辉，李志宏，杨仕明【关键词】腺病毒表达载体PackageandidentificationofreplicationdeficientrebinantadenovirusexpressionvectorofhTERT　　【Abstract】AIM:ToconstructareplicationdeficientrebinantadenovirusexpressionvectorofhTERT(AdhTERT).METHODS:ThehTERTge

2、neofCMVpromoteroftheadenoviralshuttleplasmidpDC315insensedirectionandtheresultantrebinantplasmidpDC315hTERTidpBHGlox(deltaE1,3)containingadenoviralgenome.TheadenovirusexpressionvectoricroscopicobservationandPCRcoamplification.RESULTS:Afterpurificationandconcintration,thetit

3、erofAdhTERTreached5×1012pfu/L.VirusparticlescouldbefoundinHEK293cellsundertransmissionelectronmicroscope.BothadenovirusandhTERTspecialfragmentscouldbeamplifiedfromAdhTERTbyPCR,entcouldnotbeamplifiedfromthecontrol.CONCLUSION:Thereplicationdeficientrebinantadenovirusexpressio

4、nvectorofhTERTissuccessfullyconstructed.　　【Keyantelomerasereversetranscriptase;adenovirusexpressionvector　　【摘要】目的:构建负载人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的复制缺陷型腺病毒.方法:将克隆有正义hTERTcDNA的腺病毒穿梭质粒pDC315hTERT与腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE1,3Cre共转染人胚肾293细胞(HEK293),包装负载hTERT基因的复制缺陷型腺病毒表达载体（AdhTERT）.对AdhTERT扩增、

5、纯化并浓缩后，进一步行感染性鉴定、电镜鉴定及双引物PCR鉴定.结果:纯化浓缩后的AdhTERT滴度可达5×1012pfu/L.电镜下可见在HEK293细胞中形成的病毒颗粒，PCR双引物鉴定AdhTERT可扩增出Ad及hTERT特异片段，而对照则不能扩出hTERT片段.结论:成功构建了负载hTERT基因的复制缺陷型腺病毒.　　【关键词】人端粒酶逆转录酶；腺病毒表达载体　　0引言　　人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)Mr127000，包含1132个氨基酸，其基因位于5号染色体短臂

6、的最末端（5p15.33），在90%以上的人类肿瘤中高表达，而正常成熟组织中则基本没有表达［1］，因而hTERT是一很有前景的广谱、特异的抗肿瘤治疗靶点.腺病毒载体系统具有宿主范围广、感染率高、包装容量大、繁殖滴度高、不发生整合及安全性好、性质稳定、载体制备较容易等特点,目前已成为继逆转录病毒载体后被广泛应用的载体系统［2］，可用作hTERT的异位表达工具.我们通过构建hTERT腺病毒表达载体，为进一步研究以hTERT为靶点的肿瘤免疫治疗奠定基础.　　1材料和方法　　1.1材料　　负载hTERT基因的正义复制缺陷型腺病毒穿梭质粒pDC315s

7、hTERT由本室构建保存［3］；腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE1,3Cre和转化有腺病毒E1区基因的包装细胞HEK293均由第三军医大学全军免疫学研究所邹强博士惠赠;大肠杆菌DH5α由本室保存.HindⅢ,BamHI,TaqDNA聚合酶、dNTP,PlasmidPurificationKit(Promega公司);DGL2000DNAMarker(北京鼎国试剂公司);质粒DNA小量快速抽提kit(Omega公司)；脂质体DOTAP(Roche公司)；高糖DMEM(Gibco公司);胎牛血清(HyClone公司);酵母提取物及胰蛋白胨

8、(上海生物工程公司);低溶点琼脂糖(西班牙进口分装);氨苄青霉素(华北制药厂).hTERT的PCR引物(144bp)为P1：5′CGGAAGAGTGTCTGGAGC