《油基泥浆钻井岩屑降解功能菌的选育及其特性研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
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独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的。研究成果据我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得成都理工大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料一同工作的人员对本研究所做的任何。与我贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名；／｛＾年６月曰学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解成都理工大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权成都理工大学可将学位论文的全部或部分内容编入有关数＞、、据库进行检索，可｛＾１采用影印缩印或扫描等复制手段保存汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：学位论文作者导师签名乃＾１４年ｂ月＾曰 摘要油基泥浆钻井岩屑降解功能菌的选育及其特性研究摘要随着我国页岩气勘探开发的发展，油基泥浆钻井液因具有稳定的流变性能、润滑特性和增强井眼稳定性的特点能够解决在页岩气开采过程中造成的井漏、井塌及缩颈等问题被广泛的应用，从而产生越来越多的油基泥浆钻井岩屑固体废弃物，对土壤、地表和地下水造成严重的污染以及危害到人类的健康安全。面对这亟待解决的环境问题，焚烧法和热解析法是目前处理油基泥浆钻井岩屑的主要技术，但存在一定应用的局限性。为此，本文从清洁环保的角度选用成本低、效益高、易于应用及无二次污染的微生物技术对油基泥浆钻井岩屑进行无害化处理且具有重要的实际意义。本文针对四川省珙县页岩气田的油基泥浆钻井岩屑进行理化性质及其成分分析，确定其污染物及污染程度，以原油为唯一碳原定向筛选降解功能菌；结合物理化学方法对功能菌进行生理特性研究并运用分子生物学鉴定功能菌的种属；将定向筛选出的降解功能菌开展油基泥浆钻井岩屑降解实验，研究环境影响因素，评价其在适宜条件下的污染程度并采用GC-MS仪器分析功能菌易降解的组分。取得如下结果：（1）油基泥浆钻井岩屑外观呈黑灰色，有刺激性气味，其理化性质为：pH值为7.02，呈中性；含水率为4.427%，含水率较低；化学需氧量（COD值）为187834mg/Kg；生化需氧量（BOD5值）为52990mg/Kg；含油量为67876mg/Kg；石油类是主要的污染物，其含油量在转速180rpm/min，萃取剂量在固液比为1：2的条件下，萃取6次后通过非分散红外法测定得到的，占油基泥浆钻井岩屑总量的6.8%，相对《土壤环境质量标准》最大标准值5000mg/Kg超标13.6倍，主要为C15~C19，C21，C24，C31，C43，C44的直链烷烃及部分的醇类、酯类等有机污染物。（2）从珙县油基泥浆钻井岩屑、珙县炼油厂含油废水和污水处理厂含油废水中选育出五株功能菌T-1~T-5。T1为球形、革兰氏阴性、运动性强、兼性厌氧型菌株，在0~9h为对数期，1175bp序列，为克雷伯菌属（Klebsiellasp.）；T2为长杆状、革兰氏阳性、运动性弱、兼性厌氧型菌株，在1~15h为对数期，1053bp序列，为枯草芽孢杆菌属（Bacillussubtilisstrain.）；T3为杆状、革兰氏阳性、运动性较强、兼性厌氧型菌株，在2~18h为对数期，1167bp序列，为芽孢杆菌菌I 成都理工大学硕士学位论文株（Bacillustequilensisstrain.）；T4为长杆状、革兰氏阴性、运动性弱、兼性厌氧型菌株，在6~27h为对数期，1155bp序列，为芽孢杆菌菌株（Bacillusstratosphericusstrain.）；T5为短杆状、革兰氏阴性、运动性较强、兼性厌氧型菌株，在1~18h为对数期，1131bp序列，为不动杆菌属（Acinetobactersp.）。（3）五株功能菌在10%的接种量，35℃的适应生长温度，在2:1~4:1之间的N-P比，0.5%的盐浓度条件下，通过对油基泥浆钻井岩屑的降解实验可知，在3d时降解率达到30%-37%左右，18d达到50%左右趋于稳定，30d时加入菌悬液后，降解率仍没有变化。将反应前后的油基泥浆钻井岩屑中的原油采用GC-MS分析可知，功能菌能够利用C15~C24个碳原子的小分子直链烷烃类有机物进行代谢活动，并且产生支链烷烃、酸类、酯类、醇类及环烷烃类等中间产物；产生的中间产物与难以被功能菌被降解C31、C43及C44个碳原子的高分子有机物的含量仍占油基泥浆钻井岩屑中原油总量的3.5%左右，相对《土壤环境质量标准》中最大标准值5000mg/Kg超标7倍左右，仍属于危险废物，后期实验可筛选蓄积植物的栽培考察能否达到排放标准及评价环境安全性。关键词：油基泥浆钻井岩屑功能菌特性II AbstractResearchonthebreedingandcharacteristicsofoilbasedmuddrillingcuttingsdegradationfunctionalbacteriaAbstractWiththedevelopmentofChina'sshalegasexplorationanddevelopmentofoilbasemuddrillingfluidbecauseofitsstablerheologicalproperties,lubricationcharacteristicsandenhancedcharacteristicsofboreholestabilityinshalegasminingprocesscansolvebysidewallinstabilityoccurswellleakage,holecollapseandshrinkneckproblemiswidelyused,resultinginoilbasemuddrillingcuttingssolidwastemoreandmore,onsoil,surfaceandgroundwatercausingseriouspollutionandharmtohumanhealthandsafety.Inthefaceoftheenvironmentalproblemswhichneedtobesolvedurgently,theincinerationmethodandthermalanalysismethodarethemaintechniquestodealwiththedrillingcuttingsofoilbasedmud.Tothisend,thispaper,fromtheperspectiveofcleanandenvironmentalprotection,lowcost,highefficiency,easytouseandnotwopollutionofmicrobialtechnologyforoilbasedmuddrillingcuttingsharmlesstreatmentandhasimportantpracticalsignificance.Inthispaper,thephysicalandchemicalpropertiesandcompositionanalysisofoilbasemuddrillingcuttingsinGongxianSichuanshalegasfieldareanalyzedtodeterminethepollutantandthepollutiondegree;Combinedwithphysicalandchemicalmethodsoffunctionalbacteriaforstudyonphysiologicalcharacteristicsandtheuseofmolecularbiologicalidentificationoffunctionalbacteriaofthegenus;directionalscreeneddegradatingbacteriaandtocarryouttheoilbasemuddrillingcuttingsdegradationexperimentandresearchofenvironmentalinfluencefactors,evaluationtheundersuitableconditionsthedegreeofpollutionandtheuseofinstrumentalGC-MSanalysisoffunctionalbacteriaeasilydegradablegroup.Theresultsobtainedareasfollows:(1)Oilbasedmuddrillingcuttingsappearanceisblackandgray,thereisapungentodor,thephysicalandchemicalpropertiesof:pH=7.02,neutral;themoisturecontentis4.427%,thewatercontentislow;chemicaloxygendemand(COD)is187834mg/Kg;biochemicaloxygendemand(BOD5)is52990mg/Kg;oilcontentis67876mg/Kg;theoilpollutionisthemain.Theoilcontentintheextractionspeedof180rpm/min,dosageofsolid-liquidratiowas1:2undertheconditionsofextraction6timesbymeasuringtheobtainednondispersiveinfraredmethod,oilbasedmuddrillingcuttingsaccountedfor6.8%ofthetotal,therelative"soilenvironmentalqualitystandard"maximumstandardvalueof5000mg/Kgexceedthestandard13.6times,pollutionasthemainingredientofC17~C44alkanes,branchedalkanes,alkenes,enolandnaphthenichydrocarbonandotherorganicmatter.(2)FromGongxianoilbasemuddrillingcuttings,GongxianrefineryoilrefinerywastewaterandwastewatertreatmentplantoilcontainingwastewaterintheselectionoffivestrainsoffunctionalbacteriaT-1~T-5.T1isaspherical,gramnegative,strong,III 成都理工大学硕士学位论文facultativeanaerobicstrains,thelogphasein0~9h,1175bpsequence,Klebsiella(Klebsiellasp.);T2isthelongrod-shaped,grampositive,weak,facultativeanaerobicstrains,thelogphase1~15hin,1053bpsequencefor,Bacillussubtilis(Bacillussubtilisstrain.);T3isrod-shaped,grampositive,strongmotility,facultativeanaerobicstrain,thelogarithmicphasein2~18h,1167bpsequenceforBacillusstrains(Bacillustequilensisstrain.);T4isarod-shaped,gramnegative,facultativeandweakanaerobicstrains,thelogphasein6~27h,1155bpsequence,Bacillusstrains(Bacillusstratosphericusstrain.);T5isshortrod-shaped,gramnegative,strong,facultativeanaerobicstrains,thelogarithmicphasein1~18h,the1131bpsequence,fortheAcinetobactergenus(Acinetobactersp.).(3)Fivestrainsofbacteriain10%inoculationamount,35DEGCinresponsetogrowthtemperature,betweenthe2:1~4:1N-Pratio,0.5%saltconcentrationconditions,throughofoilbasemuddrillingcuttingsdegradationexperimentsshowedthat,in3Dthedegradationratereachedabout30%-37%,18Dreached50%tendstobestable,after30days.Theadditionofbacterialsuspension,thedegradationrateremainunchanged.TheoilbasedmuddrillingcuttingsbeforeandafterthereactionofthecrudeoilbyGC-MSanalysis,functionalbacteriacanusesmallmolecularC15~C24carbonatomsofstraightchainalkanesorganicmetabolicactivities,andproducebranchedalkanes,esters,acids,alcoholsandhydrocarbonssuchasnaphthenicintermediateproduct;theintermediateproductisproducedandisdifficulttofunctionthecontentoforganicpolymerdegradationbacteriawereC31,C43andC44carbonatomsstillaccountsfortheoilbasedmuddrillingcuttingsofcrudeoilinabout3.5%ofthetotal,"themaximumrelativestandardofsoilenvironmentalqualitystandard"valueof5000mg/Kgexceedthestandard7times,stillbelongstothehazardouswaste,thelateexperimentalscreeningplantinvestigationcanachievetheaccumulationofcultivationemissionstandardsandenvironmentalsafetyassessment.Keywords:Oilbasedmuddrillingcuttings,Functionalbacteria,CharacteristicsIV 目录目录摘要............................................................................................................................IAbstract........................................................................................................................III第1章绪论................................................................................................................11.1概述..................................................................................................................11.2油基泥浆钻井岩屑的环境危害特征.............................................................21.2.1环境的影响...........................................................................................21.2.2环境中的迁移和转化...........................................................................31.2.3生物毒性...............................................................................................31.3国内外研究现状.............................................................................................41.3.1油基泥浆钻井岩屑物理化学处理技术的研究现状..........................41.3.2油基泥浆钻井岩屑生物处理技术研究现状......................................61.3.3油基泥浆钻井岩屑微生物处理技术研究现状..................................81.4课题的提出...................................................................................................111.5研究内容及技术路线...................................................................................12第2章油基泥浆钻井岩屑理化性质的分析..........................................................142.1试验材料.......................................................................................................142.2实验分析方法...............................................................................................142.2.1油基泥浆钻井岩屑的理化特性........................................................142.2.2油基泥浆钻井岩屑的含油量的测定................................................152.2.3油基泥浆钻井岩屑中有机物的组分测定........................................162.3结果与分析...................................................................................................172.3.1油基泥浆钻井岩屑的基本性质........................................................172.3.2油基泥浆钻井岩屑的有机组分析....................................................192.4本章小结.......................................................................................................21第3章降解功能菌的选育......................................................................................223.1实验材料.......................................................................................................223.1.1实验样品............................................................................................223.1.2实验主要培养基................................................................................223.1.3菌悬液的制备.....................................................................................223.2试验方法.......................................................................................................233.2.1富集....................................................................................................233.2.2分离....................................................................................................233.2.3驯化....................................................................................................233.2.4复筛....................................................................................................243.2.5纯化保种............................................................................................243.2.6降解率的测定.....................................................................................243.3功能菌的筛选结果.......................................................................................253.3.1功能菌的初筛.....................................................................................253.3.2功能菌的复筛....................................................................................253.3.3功能菌株的降解率............................................................................263.3.4纯化保种............................................................................................27i 成都理工大学硕士学位论文3.4本章小结.......................................................................................................27第4章功能菌的生理特性及鉴定..........................................................................284.1实验材料.......................................................................................................284.1.1实验样品............................................................................................284.1.2培养基................................................................................................284.2实验方法.......................................................................................................284.2.1功能菌的生理特性............................................................................284.2.2降解功能菌的分子学鉴定................................................................294.3.降解功能菌的生理特性结果......................................................................324.3.1培养特征............................................................................................324.3.2菌株的个体形态................................................................................344.3.3细菌运动性及需氧型.......................................................................354.3.4生长曲线...........................................................................................364.4降解功能菌的分子生物学鉴定结果...........................................................364.4.1琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果.......................................................364.4.2系统发育分析结果.............................................................................374.5本章小结.......................................................................................................39第5章功能菌对油基泥浆钻井岩屑的试验研究..................................................415.1试验材料.......................................................................................................415.1.1样品来源............................................................................................415.1.2试验菌剂............................................................................................415.2实验方法.......................................................................................................425.2.1环境影响因素.....................................................................................425.2.3功能菌在最佳条件下的降解效果....................................................435.2.4功能菌对石油烃类有机物的降解分析............................................445.3结果与分析...................................................................................................445.3.1环境影响因素.....................................................................................445.3.2功能菌在最佳条件下的降解效果....................................................485.3.3功能菌对石油类烃有机物的降解分析............................................505.4本章小结.......................................................................................................53结论与展望..................................................................................................................55致谢..........................................................................................................................58参考文献......................................................................................................................59攻读学位期间取得学术成果......................................................................................64ii 第1章绪论第1章绪论1.1概述随着世界经济的快速发展及低碳环保的要求，非常规气的需求量也越来越大。美国页岩气的可开采量约为28300亿立方米，2014年页岩气年产量达到2727亿立方米；加拿大页岩气年产量约为215亿立方米；我国页岩气超过美国的可采资源量，约为31000亿立方米，由于对页岩气的开采起步较晚，2015年中石化在涪陵页岩气田的年产量达到了11亿立方米，根据我国《页岩气十三五规划》，在“十三五”期间，预计到2020年页岩气年产量可突破300亿立方米。目前页岩气的开采主要以丛式水平和大位移井等非常规气井为主，与常规水平井相比，水平长，而且需配合大型分段水力压裂。页岩气储层具有渗透率低、裂隙发育和水敏感性高的特点，在水平开采中易因井壁不稳定而发生井漏、井塌及缩劲等问题。针对这种情况下，油基钻井液在钻井中具有稳定的流变性能、水损性能和润滑特性，可降低钻头磨损扭矩和阻力、减少地层和钻屑之间的相互作用力和稳定的流变性和滤失性能，在高温的情况下可以增强井眼稳定性的特点（余红波等，2006）在目前石油天然气开采过程中得到广泛的应用，从而产生大量的油基泥浆钻井岩屑固体废弃物，这是油基泥浆和钻井岩屑的混合物，主要由石油类化物、酚类化合物、岩屑及重金属组成的复杂多相体系。非常规气开采由于长期在野外作业，施工现场的所有废弃物不能及时输送至处理厂处理，导致几乎所有的废弃物全部排放堆放于废弃泥浆储存坑内。钻井废弃物固相颗粒一般在微米级，0.01-0.3um之间，具有含水率较高、粘度大且不易脱水等特点（杨知勋，2012），是一种粘稠流体或半流体。由于长期的堆积使得钻井废弃物中的有害成分，如石油类、重金属（如汞、铜、铬、镉、锌、铅等）、COD及一些化学添加剂和高分子有机物通过生物降解产生低分子有机化合物等（贺吉安，2002）积累成高浓度污染物，对环境造成污染。从环境指标来看，钻井废弃物中的主要污染物见表1-1。表1-1钻井废弃物中的主要成分污染物来源及表现含固颗粒以粘土、膨润土颗粒为主油基润滑剂和钻进油层时进入钻井泥浆中石油类的原油重金属源于钻井液添加剂和地层1 成都理工大学硕士学位论文来源主要为有机添加剂，其表现为泥浆的有机质及其分解产物CODcr值高，色度高酸碱物酸碱调节剂，表现为钻井废泥浆的pH值无机盐无机添加剂1.2油基泥浆钻井岩屑的环境危害特征1.2.1环境的影响油基泥浆钻井岩屑废弃物中较高浓度的石油类物质，其主要造成水体中的BOD含量升高，溶解油相较于分散油对水体BOD含量的贡献更为明显。其中的一些易挥发的、有毒有害、有恶臭的烃类、苯系物、蒽芘类等物质挥发在空气中，使空气中烃类污染物的浓度升高，对人类的健康造成危害，如致癌、致畸、致突变等（ChangChingyuan,etal，2000），人类对空气中各种烃类的吸入限度如表1-2。蔡利山（2003）通过糠虾试验证明废弃钻井泥浆中石油类物质的浓度越高对环境的危害越高，海洋生物学家研究表明，造成生长在海水中的鱼类、贝类等生物产生明显臭味的最小废油浓度是0.01ppm，臭味随着废油浓度增大而变浓（刘培桐，1995）。表1-2人类对空气中各种烃类的吸入限度（陈国华，2002）烃类浓度（mg/L）烃类浓度（mg/L）苯10脱臭煤油14混合二甲苯11080号稀释剂100橡胶溶剂43040号稀释剂25涂料用石油430高芳烃溶剂26甲苯浓缩油480高环烷烃溶剂380废弃油基泥浆钻井岩屑能对土壤造成的污染是极大的。其中的石油烃类物质几乎不溶于水，基本上集中在土壤20cm左右的表层，形成隔水层，改变土壤的渗透系数，降低土壤透水性，甚至堵塞土壤的导水通路；石油烃类物质与土壤颗粒表面的污泥相胶结，使土壤结块结板，破坏土壤结构，改变土壤性质，改变土壤中微生物生存的环境，从而影响土壤中酶的活性，导致农作物不能生长（刘新华，1996）。石油烃进入植物体内通过溶解析出叶绿素和脂溶性色素影响植物的光合作用；石油烃中含有的-OH、-COOH、-CHO等反应官能团通过与无机磷和氮结合从而抑制脱磷酸的作用和消化作用，土壤中的氮磷含量减少，导致土壤中的营养不均衡，影响微生物区系、微生物群落和农作物的营样缺失。2 第1章绪论废弃油基泥浆钻井岩屑也能对水体造成污染。由于石油烃类有机物具有疏水、密度比水小的性质，废弃油基泥浆钻井岩屑进入水体后，其中的石油烃就会漂浮在水面上形成一层油膜，当油膜厚度积累到1um时，就可起到阻隔空气与水体之间气体交换的作用，同时水体中的生物消耗大量的氧气，使水体严重缺氧，水体生物因缺氧发生死亡，厌氧微生物滋生，产生恶臭和浑浊等水质恶化现象。在沿岸、码头、水体自然分景区发生石油烃类污染，石油烃可依附在漂浮于水体表面的固体悬浮物上，相互聚结形成团状的油块，破坏自然景观（Bossert,I.andBartha,R，1985）。钻井废弃物中对环境造成污染的另一个特征因素是其中的重金属。钻井泥浆中的重金属离子（铬、铅、砷、镉等）不能被生物降解利用，一旦进入环境中并不断在土壤、水体及动植物的体内蓄积，最后通过食物链进入人类体内，对人类的生命健康安全造成危害（RV.Jone，1991）；（姜子东等，1992）。添加有机添加剂是为了保证钻井泥浆的稳定性，但是有机添加剂种类繁多，应用量较大，进行其对环境影响的评价时，不仅要考察有机添加剂的毒性大小，还要考察其在环境中被分解为无害物质的速度。有些添加剂毒性很小，但较难降解且长期残留，在环境中积累浓度增大，对环境的危害越大，增加了其与人或其他生物接触的可能性（张建成，2007）；（吕开河等，2001）。油基泥浆钻井岩屑中的可溶性的无机盐类高于环境无机盐背景值数倍，能够激发潜在的污染。1.2.2环境中的迁移和转化油基泥浆钻井岩屑在环境中的迁移主要在陆相环境和水相环境两个方面：在陆相环境中，油基泥浆钻井岩屑中的某些组分如金属可与土壤发生反应，这一过程涉及的主要作用有：离子交换、化学沉淀、吸附、与有机物的络合作用和微生物的降解作用；在水相环境中，油基泥浆钻井岩屑中的组分主要是针对有机物而言，其中的有机物随水相发生迁移，进而进入土壤中进而被吸附参与微生物或者动植物的活动等。我们一般把流体力学过程、非生物过程和生物过程认为有机物在环境中变迁的三个阶段（向兴金，2001）。1.2.3生物毒性废弃油基泥浆钻井岩屑具有一定的生物毒性，其毒性与重金属和高分子有机物的浓度成正比，此外，其中大分子有机物被微生物代谢产生的小分子有机物和人为添加剂对环境中的鸟类和鱼虾也具有一定的危害作用。有学者研究废弃油基钻井泥浆中有机组分的环境危害，结果表明：植物受其3 成都理工大学硕士学位论文中的石油烃类和木质素磺酸盐类污染的影响最大（AmericanPetroleumInstitute，1983），虽然没有重金属盐类等污染物影响程度大，但是石油烃类在环境中较难降解，降解木质素磺酸盐的中间产物和最终产物较为复杂，其中包括分类和硫醇等，同样对植物存在潜在的危害。废弃钻井泥浆中常含有醛和胺类的杀菌剂，对鱼、鸟类生物也有毒害作用，对环境也存在潜在的危害，由于环境对一定浓度的污染物具有一定的自净能力，上述影响可以得到减轻或者消除，但是污染物的浓度超过了环境的自净能力，危害就越来越严重；环境中的微生物对废弃油基钻井泥浆中淀粉、纤维素、醇类和油类等化合物有一定的降解作用（易邵金，2001），但是还有一些黄原胺、木质素磺酸盐、聚丙烯酰胺和浙青等添加剂不易降解，而且对环境的生物毒性较大，因此废弃油基钻井泥浆必须进过无害化处理，并达到相应标准才能向环境中排放。1.3国内外研究现状1.3.1油基泥浆钻井岩屑物理化学处理技术的研究现状目前国内外针对油基泥浆钻井岩屑的处理技术有传统的就地排放法（B.D.Freeman，1989），指定场地集中处理法（徐良伟等，2001），填埋冷冻法（JeanS.W，2000），化学固化法，固液分离法（杨耀，2008），钻井泥浆回收利用技术（潘宝凤等，2011），破乳法，钻屑综合利用法，焚烧法，热解析法等技术，其中焚烧法、热解析法是对于油基泥浆钻井岩屑的处理应用最为广泛。就地排放法是经自然沉降或者机械脱水后加入适量的化学絮凝剂对常规钻井泥浆的处理方法，具有费用低，易操作等特点；指定场地集中处理法是用抽吸车将废弃油基泥浆钻井岩屑运至集中处理场所进行处理的方法，该方法处理费用较高，增加了处理的成本；冷冻填埋法主要是针对寒冷地区油基泥浆的处理，通过将废弃钻井泥浆和钻屑注入冻土层达到处理的目的，具有无需迁移的优点，但是受到区域的限制；化学固化法是通过加入固化剂（孟苗，2008）；（宋延博，2007）以及破乳剂、吸附剂，与钻井泥浆作用，从而形成抗水固体，由于其具有一定的强度和一定的稳定性，能封闭、包裹废弃固体废物中的有害成分以达到对主要有木质素磺酸铬、膨润土型、油基钻井液、部分水解聚丙烯酰胺等钻井液体系（夏村，1984）；（周迅，2001）的处理目的，具有能降低废弃固体废物中的重金属离子和有机物对土壤、水体和生态环境造成的影响和危害的优点；成本高，不适合对大量废弃钻井泥浆进行固化施工的缺点；固液分离技术适用于钻井泥浆脱水处理，通过加入混凝剂，过滤离心，机械分离等步骤进行钻井泥浆的处理，具有脱水效果好的优点；化学强化脱水作为机械分离的前处理步骤的缺点；钻井泥浆回4 第1章绪论收利用技术通过加固化剂，按一定比例混合形成混凝土（赵伟民等，2008）、将无用的成分除去，再分析其成分含量，补充必要的钙、硅、铁、铝等水泥所必须的元素，达到水泥的标准用于建筑上、生成水泥的原材料和改善湿地（李颖等，2006）；（刘涛等，2007）。焚烧法主要针对含油率较高的油基泥浆钻井岩屑的处理，燃烧产生的热能可回收利用，具有一定的经济价值和使用价值（李彦超等，2010），在国外是一种较为常用的处理技术。焚烧法要求具有很高的温度(1200～1500℃)和热能回收装置，燃烧产生的气体须经过除尘装置和有害气体吸收装置以使烟气达到环保要求，剩余的灰烬可综合利用，如生产陶瓷颗粒或者建筑材料等。油基泥浆钻井岩屑在焚烧前需经脱水、干化等预处理，便于引燃和燃烧油基泥浆钻井岩屑，减少因含水率较高而损耗的能源，降低处理成本。焚烧法是一种操作简单且实用的处理方法，对油基泥浆钻井岩屑焚烧后，其大部分石油烃类有机物被焚烧完全，减少了对环境的危害，具有体积减容比高、处理工程安全等优点；油基泥浆钻井岩屑中含有的一些化合物经焚烧后产生的有毒有害气体（如二噁英等）、颗粒物等造成二次污染，浪费大量的资源，如有热能回收装置回收利用热能（姜勇，2005），可降低处理成本，实现经济合理化。热解析技术是通过加热的方式使有机污染气化成蒸汽从受污染介质中分离冷却回收的过程。燃烧气体、惰性气体或者空气被作为蒸发污染物质的交换介质。热解析系统就是将污染物从液相转化为气相的物理分离过程。热解析技术在二十世纪80年代初被美国军方首次用于修复储油库污染土壤的项目中，经过发展该技术在美国和加拿大等西方国家已成为市场化的成熟技术，应用于纵多的环境修复项目中，包括土壤和地下水等修复基金项目。（王铭剑，2011）热解析技术有直接或间接热交换的两种方式，直接加热是指被加热物质与加热介质直接接触，适用于低挥发性物质污染的固体废弃物的处理，对系统有较高的气密性要求，但存在二次污染的缺点；间接加热采用蒸馏和冷凝回收的方式，适用于高挥发性物质污染的固体废弃物的处理，可以克服直接加热二次污染的缺点,其工艺如图1-1。根据污染物被加热所能达到的气化温度，可将热解析技术分为两类：低温热解析技术（150~315℃）和高温热解析技术（315~540℃）。（郑婷婷，2015）图1-1间接式旋转窑热解析工艺流程5 成都理工大学硕士学位论文郑婷婷等（2015）将热解析与焚烧处理技术的联用，对含油钻屑的处理能够达到国家有关污染物排放的标准。通过热解析炉内间接加热蒸馏回收油品后，从炉内出来的废渣中的含油量为0.8%~1.6%，满足处理后低于2%的要求。焚烧窑直接焚烧废渣，排放浓度为100~150/m3的烟（粉）尘，黑度为1级的烟气，符合《工业炉窑大气污染物排放标准》(GB9078-1996)的标准，产生的残渣里层含油量为0.007%，表层为0.004%，符合含油量小于0.3%的标准。耿春雷等（2012）对某焦化厂PAHs污染土的修复采用回转窑高温热解析技术、高温蒸汽回用系统、二燃室、燃烧系统等技术，污染土壤中PAHs污染物含量降低了67.3mg/kg，其达到了99.41%的去除率，废渣可安全回填或者添加营养物质用于种植。1.3.2油基泥浆钻井岩屑生物处理技术研究现状油基钻井液主要分为柴油基钻井液、原油基钻井液和白油基（王茂等，2011）钻井液，其主要成分是饱和烃类，含有少量的芳香烃类碳氢化合物。目前，生物处理技术主要集中在含油污泥的处理研究中，对于油基泥浆钻井岩屑的研究较少。张红岩等（2015）采用“WODS+锯末+营养物+微生物”的堆肥方案降解废弃油基泥浆中的石油类污染物取得了较好的效果。Zimmeeman和Robert等(McCartyPerryL,1985)利用堆肥法对油基钻屑进行处理，使烃类有机污染物降低了83%，李学庆等(2013)通过离心甩干和生物法对新疆白油包水钻井液和全油基钻井液中的钻屑进行了处理，取得了将含油量降至1.17%的良好的效果。生物处理技术（孙远军，2006）是近年来为净化环境发展起来的一项发展潜力较大的新型技术，具有成本低、效益高、易于应用的特点。中科院生态环境研究中心的王庆仁博士对生物修复的定义为：利用特定生物（植物、微生物或原生动物）的吸收、转化来清除环境污染物，实现环境净化、生态效应恢复的生物措施。目前生物处理主要分为原位处理（地耕法）和异位处理（污泥反应器法、堆肥法）两种方式。1.3.2.1微生物处理技术微生物处理技术是指利用土壤中的土著菌或添加经驯化得到的高效降解微生物，存在于土壤中有害的石油类污染物经微生物吸收、氧化还原等途径降解成二氧化碳和水或者转化为无毒无害的中间产物物质（LiYetal，1983）。微生物技术自1985年日本三好学博士（李介春译，1987）发现灰绿色葡萄霉菌分解葡萄果皮蜡质烃类物质已有百余年历史，目前其在石油烃类污染修复中逐渐成为了技术的核心，在石油烃类污染的场地修复实例中所占比例越来越重，这种方法高效、经济、绿色，迅速得到广泛应用。目前常用的有生物刺激、生物强化和生物衰减三种方法。6 第1章绪论⑴生物衰减法(Bioattenuation)，指通过自然界土壤微生物的自然降解作用，将污染物转化成无毒无害的物质或发生矿化的方式。这种方法属于自然方法，污染物没有特异性，适合于场地受到苯系物等石油烃污染的治理（AtteiaO,GuillotC，2007）。使用生物衰减法能够节约成本，如美国应用这种方法对400出污染场地进行了修复，相比物理化学法，节约了近80-90%的成本（MegharajM,etal，2011）。⑵生物刺激法(Biostimulation)，指在场地修复时，通过向土壤中加入微生物所需营养物质如KH2PO4、KNO3、K2HPO4、NH3NO3和一些微量元素等，以以水溶、缓释、亲油等方式添加到土壤中（NikolopoulouM,etal，2007），以及曝气增氧等措施，刺激土壤中微生物大量繁殖进而对污染物进行讲解，以达到快速修复的目的。QinG等（2013）将稻草和生物炭添加到土壤中，石油烃降解明显增快，并且生物炭的添加时间对石油烃的去除效果有明显影响。而IjahU等（2013）将豆渣添加到土壤中，28d后，石油烃降解率达70.4%。⑶生物强化法(Bioaugmentation)，指将从环境中筛选得到的高效降解菌投加到污染土壤中，对污染物进行降解，以达到快速降解的目的。MukherjeeAK等（2011）将石油烃降解菌群到投加石油污染土壤中，180d后，石油烃降解率达到76%，明显高于空白对照的3.6%。GargouriB等（2014）在石油污染土壤中投加驯化菌群后，污染物浓度从63.4mg·g-1降至2.5mg·g-1。1.3.2.2植物处理技术植物处理技术（廖长君，2015）指利用植物根系吸收或隔离污染物的场地污染修复技术。植物处理开始于重金属土壤的治理，特别是超积累植物的发现之后，植物修处理技术发展迅速，成为研究热点，因植物，如玉米、绿豆、黄豆等农作物（Dominguez-RosadoE,etal，2004）具有耐受高污染浓度和根系发达的特点（KhanS,etal，2013），在有机物污染土壤中也得到了广泛的使用。而WangK等（2013）则将重金属超积累植物东南景天和黑麦草复合种植同时修复重金属和多环芳烃，效果良好。1.3.2.3动物处理技术在油基泥浆污染土壤治理中除了微生物和植物，动物也可以用于修复当中以及和微生物、植物处理技术进行联合运用。如在石油污染土壤治理的微系统中，蚯蚓对石油烃的降解具有良好的效果（FernandezMD,etal，2011），而且还能作为石油污染土壤毒性检测的指示生物（HentatiO,etal，2013）。蚯蚓和微生物或者植物修复技术进行联合运用时，蚯蚓对土壤的微扰动，可以增加土壤与空气的气体交换作用，从而提高微生物对石油烃类的降解速率。7 成都理工大学硕士学位论文1.3.3油基泥浆钻井岩屑微生物处理技术研究现状在20世纪70年代，美国埃索研究和工程公司为解决因输油管线和储油罐在非正常运行时发生渗漏引起的土壤污染问题，在其实验室研究发现了一种有效的及清洁的“细菌播种法”生物解决方法，很好的缓解了石油污染土壤的问题，开创了生物技术对石油污染土壤修复的先河（曹刚等，2005）。从20世纪80年代开始着手于利用微生物修复环境污染的基础研究，美国环保局在阿拉斯加ExxonVallez成功的利用生物技术对石油泄漏的工程完成污染修复是最典型的一个例子，这也对生物修复技术的发展带来了里程碑的意义（O'brien，1995）。针对因原油管理不善导致泄漏而造成的海岸线污染，Exxon公司和美国EPA的科学家们在两年多时间的里去除了海岸线污染油污完成修复工程，其中生物修复技术是主要措施并发挥了巨大作用。微生物在对石油烃类污染修复中具有有良好的修复效果、经济环保而显现出巨大的魅力，因此，引起了越来越多的科学家们的关注和研究，使得微生物修复技术得到了巨大的发展。20世纪90年代，微生物修复技术在对被污染的科威特沙漠和美国Oklahama大草原土壤的修复过程中效果十分明显；在1992年10月，阿根廷科学家在因700t油罐发生泄漏的土壤污染修复中所采用的修复技术正是利用土著微生物通过施用肥料作为微生物营养物质的方法；科威特科学家成对因石油泄漏而造成污染土地的成功修复，（吴启堂，2006）也是利用的微生物技术。2001年，S.MnaaCpaelli（2001）将假单胞菌属（Psuedomonas）和黄杆菌属（Floabacetriunl0微生物合用，经过14d对含油污水的降解率达到了89%。印度尼西亚采用好氧微生物对加里曼丹地区堆放油含量低于10%的18000桶油基钻屑进行了处理270d后，油含量降低至1%以下。（Claude-HenriC.2003.）；（SaumanMandDewandonoAandHasanR，2004）我国在微生物修复这方面的研究同样取得了很多的研究成果。中科院生态环境研究中心环境水化学国家重点实验室采用通过筛选获得的厌氧菌、好氧菌、酵母菌等菌株处理稠油废水，取得了较好的处理成果（宫健，2000）；郑少奎，汪严明等（1999）人在石油污染土壤中筛选获得对色拉油加工废水有处理效果的酵母菌群，对高浓度色拉油加工废水采用摇瓶进行降解试验，结果表明酵母菌菌群对色拉油具有一定的降解能力；中科院南京土壤研究所微生物研究室，通过分离筛选获得的动胶菌(Zoogloeasp.)D.2菌株，并采用生物接触氧化法将该菌株作用于含有机械润滑油废水的治理中，对润滑油的去除达97%以上（谢思琴等，1999）；慎以勇，黄志立等（2000）在不同的活性污泥中筛选驯化分离得到12种不同菌株，通过对含高浓度油脂型污水的降解试验可知去油率最高可达90%以上。土壤中存在大量的具有氧化分解有机物能力并以此为营养物质存活的微生物，如真菌、放线菌、细菌等。土壤被石油污染后，以石油烃类为碳原的微生物8 第1章绪论在其诱导下产生氧化降解污染物的酶系，并将污染物氧化降解转化为二氧化他和水等环境友好物质。土壤中微生物的种类成千上万，对不同的有机污染在不同的条件下的分解形式也是多种多样，主要有氧化还原、水解、环破裂羟、异构化和基化等过程，并最终将大分子有机物降解为对生物无毒性的水、二氧化碳及残留物，这与土壤中微生物的种群、活性、数量，以及土壤中的温度、水分、pH值、Eh值、通气性、适宜的C/N比等因素有关。通常采用增加碳C/N等营养元素、土壤与空气的气体交换作用或引入优势微生物种群等措施，强化微生物的降解作用，促进污染物的生物降解（王隆丹，2008）。在20世纪，有学者研究发现细菌和酵母菌能够有效的氧化分解石油类污染物质。还有研究学者发现，一些微生物不仅对烷烃有降解能力，还具有氧化降解环状烃和稠环芳烃的能力。据已有报道，有70个种属（其中真菌30个属，细菌28个属），200多个种的微生物能降解烃类有机物（丁克强等，2000）。在高温高压或寒冷的两极地区等极端的环境下，仍存在大量石油烃类降解微生物（WhyteL.G,etal，1998）。1997年，科学家在阿拉斯加州和加拿大北部，于寒冷地层中探测到以石油烃为生长基质进行生长繁殖的微生物（MohnW.W,etal，2001）。NamioK,etal（2005）在北极地区通过接种抗寒微生物混合菌种修复石油污染的土壤一年后，土壤中石油的降解率在21%左右。研究发现，微生物群落结构中起主要作用的是Cellulomonasflavigena,Rhodococcuserythropolis和Arthrobactersp.等（ShuchiV,etal，2006），一般认为，放线菌、真菌对原油的分解能力弱于细菌，但也有科学家发现，某些种类的真菌在降解原油的效果更为显著（黄艺等，2002）。水和底部沉积物在受到严重油污染后，其中存在着大量降解原油的微生物，微生物可达到102～106ind·ml-1的数量，高出1～2个数量级比非污染区（刘润进等，2000）。土壤中除了细菌和放线菌等种类外，降解石油烃类的还有真菌，如镰刀霉属（Fusarium）、曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、被孢霉属（Mortierella）、大量丝状真菌、毛霉属（Mucor）和木霉属（Trichoderma）。9 成都理工大学硕士学位论文表1-3部分石油类降解菌属细菌霉菌酵母菌放线菌藻类无色杆菌属诺卡氏菌属曲霉(Aspergillus金色担子菌属(Achromobacter(Nocardia颤藻属(Oscillatoria)sp.)(Aureobasidsp.)sp.)sp.）放线菌属不动杆菌属键刀霉属假丝酵母属鞘藻属(Actinomyc(Acinetobactersp.)(Fusariumsp.）(Candidasp.)(Oedogonium)etessp.)产碱杆菌属毛霉属（Mucor红酵母属—鱼腥藻(Anabaena)(Alcaingnessp.)sp.）(Rhodotorulasp.)掷孢子酵母被孢霉属节杆菌属霉属(Mortierella—念珠（Nostoc）(Archrobactersp.)(SporobolomycesSp.)sp.)短芽孢杆菌属青霉属(Penicillum球拟酵母属隐球藻—(Brevibacillussp.)sp.)(Tourlopsis)(Aphanocapsa)棒杆菌属木霉(Trichoderma酵母—小球藻(Chlorella)(Coryneformssp.)sp.)(Sachcaromyels)芽抱杆菌属莫拉氏菌属衣藻——(Crobacteriumsp.)(Moraxellasp.)(Chlamydomonas)黄杆菌属(Flavobacterium————sp.）微球菌属————(Micrococcussp.）微杆菌属(Microbacterium————sp.)假单胞菌————(Pseudomonassp）苍白杆菌属(Ochrobactrum————sp.)沙雷氏菌属————(Serratiasp.)小球菌属————(Pediococcussp.)10 第1章绪论1.4课题的提出随着我国页岩气勘探开发的不断发展，越来越多非常规气井、多分支井、水平钻井运用在开采中，因井壁不稳定而发生井漏、井塌及缩劲等问题越来越突出，油基钻井液技术因稳定的流变性能、水损性能和润滑特性受到越来越多的重视和发展，但是油基钻井液技术广泛的应用在页岩气的开采中，越来越多的油基泥浆钻井岩屑废弃物在开采的过程中产生，预计全国每年产生的油基泥浆岩屑将达到36万吨。我国虽未将废弃油基钻井岩屑收入《国家危险废物名录》，但欧盟在2001/118/EC《废物/危险废物名录》中明确规定：危险废弃物是指钻井液和废弃物中主要有含油、含危险物质等成分｡当前，对钻井岩屑的含油量国内外均有严格的要求，我国在GB4914-2008《海洋石油勘探开发污染物排放浓度限值》中规定，禁止将含油钻井废弃物排入环境敏感海域（如渤海湾等）；从2000年11月后欧洲等国家要求达到零排放。环境标准的日益严格，使得研究油基泥浆钻井岩屑处理技术，实现其无害化具有重要意义且势在必行。表1-4欧盟2001/118/EC《废物/危险废物名录》0105钻探泥浆和其他钻探废物010504淡水钻探泥浆和废物010505*含油的钻探泥浆和废物010506*含危险成分的钻探泥浆和其他钻探废物010507除010505和010506外的含重晶石的钻探泥浆和废物010508除010505和010506外的含氯化物的钻探泥浆和废物010599无其他特殊说明的废物注：*表示危险废物。页岩气在开采过程中产生大量的油基泥浆钻井岩屑固体污染物。它是油基泥浆和钻井岩屑的混合物，主要是由石油类化物、重金属、岩屑及酚类化合物组成的复杂多相体系，其具有较高的浸出毒性。钻井泥浆岩屑含油率一般在10%以上，含水率在40%~90%，主要是在石油天然气开采的过程中产生（姜勇，2005）。油基泥浆作为油基泥浆钻井岩屑的重要组成部分，其高COD，高石油类污染物对土壤、地表和地下水的污染。破坏土壤结构及土壤微生物的生存环境，影响了土壤酶的活性，从而千扰作物的生长；人类通过皮肤接触和食用受污染的食物进入体内进而危害到人类的健康和生命安全，甚至引起致癌、致畸、致突变等健康问题以及一些添加剂如聚丙烯酰胺、木质素磺酸盐、黄原胺和沥青等不易降解的环境问题。大量的油基泥浆钻进岩屑废弃物没有安全有效出路，己成为页岩气开采的严重负担，同时严重制约着油基钻井液的发展。因此，研究废弃油基钻井岩屑11 成都理工大学硕士学位论文的无害化处理技术具有重要的实际意义。目前国内外对油基泥浆岩屑废弃物的主要处理技术有回注、热蒸馏（热解析）法、溶剂萃取法、焚烧法、坑内密封掩埋法、热解析法、生物修复、甩干分离等方法。在工程应用中应用较多的有焚烧法、热解析法、微生物降解法、甩干分离法等。但是处理技术都存在一定的局限性。焚烧工艺是目前最常见的危险废弃物处置方法，油分处理最为彻底，但是不能回收油分，并且有二次污染产生。机械分离工艺最为简单，可回收部分油，但处理效果非常差，含油量比较高，一般常作为预处理。热解析法是一种比较先进的回收利用技术，最突出优点是能回收含油岩屑中绝大多数油分，但仍然含有2%左右的油，不能达到一般工业固废标准。此外，由于近年来钻井岩屑产生量的逐年增多，现有危废处理单位也难以满足处理需要。因此开发油基泥浆钻井岩屑的快速无害化处理技术是发展的趋势。微生物降解法作为一种较为节省能耗的处理工艺，对油分和重金属均具有去除效果，而且对于环境没有二次污染受到了越来越多学者的关注及研究。基于此，从自然界中筛选出降解油基泥浆功能菌株，结合物理化学方法对降解功能菌生理特性及降解试验进行研究，形成一套技术可行、经济合理的固体废弃物处理技术，实现清洁钻井，促进页岩气勘探开发与环境保护协调发展，对整个非常规气行业的发展具有非常重要的意义。1.5研究内容及技术路线（1）通过对油基泥浆钻井岩屑的理化性质（含水率、含油率、pH、化学需氧量COD及生化需氧量BOD5）测定，与《农用污泥中污染物控制标准》和《土壤环境质量标准》对比分析油基泥浆钻井岩屑的污染程度；并对油基泥浆钻井岩屑中石油烃类有机物的组分分析，为后续实验提供基础。（2）通过从油基泥浆钻井岩屑、炼油厂含油废水及污水处理厂含油废水中筛选得到降油菌，通过复筛实验得到降油的功能菌，选取降解效果较好的功能菌对其进行菌落形态、革兰氏染色、运动性及需氧型观察，测定其生长曲线以及种属的鉴定分析。（3）将筛选分离得到的高效降解功能菌，作用于油基泥浆钻井岩屑进行降解实验，并考察其不同的接种量，不同的主要环境影响因素（pH、温度、N-P比和NaCl浓度）下的降解情况，找到功能菌的最佳降解条件；了解功能菌在最佳条件下对油基泥浆钻井岩屑的降解效果及反应前后石油烃类有机物的组分分析，初步探讨功能菌对其易降解的成分。本论文研究的技术线路见图1-2。12 第1章绪论图1-2技术线路图13 成都理工大学硕士学位论文第2章油基泥浆钻井岩屑理化性质的分析本章通过对珙县油基泥浆钻井岩屑的基础指标进行分析，了解主要污染物的组分及含量，确定其污染程度，为微生物对珙县废弃油基泥浆钻井岩屑的无害化处理提供基础。2.1试验材料试验选用的油基泥浆钻井岩屑取至珙县油田，该样品外观呈黑灰色，具有浓烈的刺激性气味（图2-1）。图2-1试验油基泥浆钻井岩屑样品2.2实验分析方法2.2.1油基泥浆钻井岩屑的理化特性2.2.1.1油基泥浆钻井岩屑的含水率含水率采用烘干法进行测定，具体如下：（1）将油基泥浆岩屑碾磨粉碎过60目筛，备用。取6个洁净的坩埚，并编号Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y6。放入电热鼓风干燥箱中，温度设为105℃，烘干4小时后，放入干燥器中冷却至室温，采用电子天平称其重量，重复多次至恒重，称重分别为M1，M2，M3，M4，M5，M6；（2）分别称取6份10g左右碾磨后油基泥浆岩屑，置于6个坩埚中称重并记录油基泥浆岩屑实际质量为m1，m2，m3，m4，m5，m6；（3）将盛有油基泥浆岩屑的坩埚置于电热鼓风千燥箱中，调节温度至14 第2章油基泥浆钻井岩屑理化性质的分析105℃，供干4h以上，直至水分完全蒸发后，在干燥器中冷却至室温称重。重复几次至重量基本恒定不变，记录数据M1′，M2′，M3′，M4′，M5′，M6′；（4）计算挥发水分的质量及其百分含量；（5）计算样品平均值。油基泥浆岩屑含水率计算公式：（Mm）-M'含水率(%)100%m（2-1）式（2-1）中：M—坩埚质量，g。m—烘干前油基泥浆岩屑质量，g。M′—坩埚和烘干后油基泥浆岩屑的总质量，g。2.2.1.2pH的测定将油基泥浆岩屑碾磨过筛（60目）后用超纯水浸泡，搅拌、静置24h，按照pH计的操作要求，准确测定上层浸泡液的酸碱度。2.2.1.3化学需氧量（COD）化学需氧量（COD）的测定采用哈希快速消解测定法。2.2.1.4生化需氧量（BOD5）生化需氧量（BOD5）的测定采用无汞压力测定法。2.2.2油基泥浆钻井岩屑的含油量的测定油基泥浆钻井岩屑的含油量可采用非分散红外法进行测定，因为含油类污染物中大多数物质的全部或部分分子官能团能在2930cm-1、2960cm-1、3030cm-1处有特征吸收峰，将光谱能量的吸收进行定性分析和定量计算。非分散红外检测方法具有分析时间短、测量结果准确，可比性高、测量精密度高（RSD%<1.5%）、波数准确率（±2cm-1）及重复性（≤1%）高等特点广泛应用在监测海水、地下水、地表水、生活用水和工业废水等各种水体及土壤中动植物油、石油类（矿物油）及总油的含量。具体步骤如下：（1）标准曲线的制作：分别取1000mg/L的标准油0.05ml、0.1ml、0.25ml、0.5ml、0.75ml、1.00ml、2ml于25ml容量瓶中，加四氯化碳定容到刻线（则稀释后的油含量分别为2mg/L、4mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、80mg/L)。以四氯化碳为空白，用非分散红外测油仪测定吸光度，得出标准曲线。（2）将油基泥浆岩屑碾磨粉碎过60目筛，备用；15 成都理工大学硕士学位论文（3）从油基泥浆岩屑中油品能够萃取完全及节约能源的角度考虑，设计萃取次数、转速及萃取剂剂量的单因素实验。具体如下：①萃取次数及萃取剂剂量：取12个50ml锥形瓶，洗净，在恒温干燥箱内110℃，烘至恒重。然后称取5g油基泥浆岩屑于锥形瓶中，分别加入5ml、10ml、15ml和20ml石油醚（30-60℃），在恒温水浴锅中，20℃，180rpm萃取2h，静置取出上清液，重复此操作6次。将萃取液4000rpm离心10min后，蒸馏得到油品，油品放置48h后用四氯化碳定容至25ml容量瓶中，以四氯化碳为空白，用非分散红外测油仪测定吸光度，计算含油量。每组3个平行样；②转速：取15个50ml锥形瓶，洗净，在恒温干燥箱内110℃，烘至恒重。然后称取5g油基泥浆岩屑于锥形瓶中，分别加入10ml石油醚（30-60℃），分别在恒温水浴锅中，20℃，160rpm、180rpm、200rpm、220rpm和240rpm萃取2h，静置取出上清液。将萃取液4000rpm离心10min后，蒸馏得到油品，油品放置48h后用四氯化碳定容至25ml容量瓶中，以四氯化碳为空白，用非分散红外测油仪测定吸光度，计算含油量。每组3个平行样。（4）通过萃取次数及萃取剂剂量的试验中，计算出油基泥浆岩屑中的含油量。油基泥浆岩屑含水率计算公式：mmmmmm123456含油率(%)100%M(2-2)式（2-2）中：m—分别为萃取的含油量，mg。M—为油基泥浆岩屑质量，g。2.2.3油基泥浆钻井岩屑中有机物的组分测定取1个250ml锥形瓶，洗净，恒温干燥箱内110℃干燥后，秤取50g油基泥浆岩屑于锥形瓶中，然后加入100ml石油醚（30~60℃），在恒温水浴锅中，20℃，180rpm萃取2小时，静置取出上清液。重复此操作6次。将多次萃取得到的样品4000rpm离心10min后，取出自然风干后得到油相作为有机质的测定样品，样品送至中国科学院成都分院有机化学所进行GC-MS测定分析。实验采用多次少量的萃取原则，尽可能最大限度的获得油基泥浆钻井岩屑中的有机质。GC-MS分析实验条件：色谱条件:色谱柱为30m×0.32mm的OV-101石英毛细管柱，柱温40℃，停5min再以10℃/min升至150℃，停2min再以5℃/min升至290℃，汽化温度290℃，检测温度270℃，载气N2，柱前压0.4kg,检测器FID。质谱条件:离子源为电子轰击源(EI)、电子能量70eV、加速电压3kV、分辨率16 第2章油基泥浆钻井岩屑理化性质的分析1000、真空度1.33×10-4Pa，进样系统温度190℃、电离室温度250℃、扫描范围m/z22—600。2.3结果与分析2.3.1油基泥浆钻井岩屑的基本性质油基泥浆钻井岩屑是页岩气开采过程中产生的固体污染物。它是油基泥浆和钻井岩屑的混合物，主要有石油类化物、酚类化合物、岩屑、重金属及一些化学添加剂和高分子有机物通过生物降解产生低分子有机化合物等物质都可能对环境造成严重的危害。（1）油基泥浆钻井岩屑含水率的测定结果（表2-1）。表2-1含水率的测定结果坩埚质油基泥浆105℃后坩埚和油含水率编号含水量/g含水率/%量/g岩屑质量/g基泥浆岩屑总质量/g平均值/%117.654910.008327.22260.44054.402217.640710.024327.20660.45834.572317.147910.007226.71160.44344.4314.427417.58929.924727.08590.42794.312517.13679.987326.68940.43454.351617.276410.003626.83070.44924.491（2）油基泥浆钻井岩屑含油率的测定结果：1）非分散红外测油标准曲线（图2-2）。1009080y=1.1395x-1.423670R²=0.9993A/605040吸光度3020100020406080100浓度mg·L-1图2-2红外测油标准曲线17 成都理工大学硕士学位论文2）萃取单因素实验①萃取次数及萃取剂剂量对萃取的影响2502001:11501:2/mg1:3含油量1001:4500123456萃取次数图2-3萃取次数及萃取剂剂量的影响由图2-3可知，萃取剂量越高，初始萃取出油量越高，随着萃取次数的增加，萃取出油量减少，萃取剂量在固液比为1：2，1：3，1：4均在第6次萃取完全。在萃取两次后，油基泥浆钻井液仍然没有完全的分散，导致在第3次萃取出的油量较小，在图上的曲线相对平缓，如图2-3。萃取剂为石油醚，为有机溶剂，考虑其对水体、土壤和大气均可造成污染及对人体有一定的伤害，故萃取完全的最佳萃取条件为萃取剂量1：2，萃取6次。②转速对萃取的影响200180160mg/140含油量12010080160180200220240转速rpm/min图2-4转速的影响转速对萃取的影响主要表现在较低的转速下，不能将油基泥浆钻井岩屑充分的分散，从而影响萃取量降低。随着转速的增加，油基泥浆钻井岩屑分散开，萃18 第2章油基泥浆钻井岩屑理化性质的分析取量增加，在180~200rpm/min时达到最大并保持平衡。转速过高，萃取剂与油基泥浆钻井岩屑的摩擦造成局部温度的升高，萃取剂易挥发，导致萃取量有所下降（图2-4）。故在萃取的过程中选择180prm/min的转速。含油量的计算𝑚1+𝑚2+𝑚3+𝑚4+𝑚5+𝑚6含油量==67876𝑚𝑔/𝐾𝑔𝑀综上所述：油基泥浆钻井岩屑的理化性质为：pH值为7.02，呈中性；含水率为4.427%，含水率较低；化学需氧量（COD值）为187834mg/Kg；生化需氧量（BOD5值）为52990mg/Kg；含油量为67876mg/Kg；外观呈黑灰色，具有浓烈的刺激性气味，长时间放置外观未发生变化。根据上述数据，油基泥浆钻井岩屑中的石油烃类有机质含量约占油基泥浆钻井岩屑总量的6.8%，相对于《土壤环境质量标准》（GB15618-2008）中规定的一级标准≤100mg/Kg标准值，超标679倍，二级居住标准≤1000mg/Kg标准值，超标68倍，二级工业标准≤5000mg/Kg标准值，超标13.6倍；相对于《农用污泥中污染物控制标准》（GB4284-84）中规定的标准值≤3000mg/Kg，超标22倍。其COD、BOD5值更是远远的超过《农用污泥中污染物控制标准》（GB4284-84）标准中规定的标准值30mg/Kg、150mg/Kg，分别超过标准值的1252倍、1765倍。由于废弃油基泥浆钻井岩屑中的石油烃类有机物较高的含量，不能直接用于任何行业，如若直接排放或者管理不当会对环境造成严重的危害，因此，废弃油基泥浆钻井岩屑必须经过无害化处理后才能排放至环境中或者作为其他用途。2.3.2油基泥浆钻井岩屑的有机组分析本章采用非分散红外法对油基泥浆钻井岩屑的含油率进行了测定，结果显示油基泥浆钻井岩屑中的石油烃类有机物含量较高，约占废弃油基泥浆钻井岩屑总量的6.8%，与《土壤环境质量标准》（GB15618-2008）和《农用污泥中污染物控制标准》（GB4284-84）对比，最低超标《土壤环境质量标准》中二级工业用地标准13倍多。说明废弃油基泥浆钻井岩屑中的石油烃类有机物是主要的污染物质，可作为碳原被微生物利用的主要目标物质。针对废弃油基泥浆钻井岩屑中石油烃类有机物这一主要污染物，本实验以石油醚（30-60℃）为萃取剂，采用GC-MS(气相色谱-质谱联用)对其有机组分进行了测定分析，结果如图。19 成都理工大学硕士学位论文图2-5油基泥浆钻井岩屑原油有机成分GC-MS谱图由图2-5油基泥浆钻井岩屑原油有机成分GC-MS谱图分析可知：在保留时间16.9~46.0min处均有峰出现，说明油基泥浆钻井岩屑废弃物中有机物成分复杂。根据峰的出现时间及其分布情况，油基泥浆钻井岩屑废弃物中的有机物的组分主要是直链烷烃，烯烃，醇类及酯类有机物，表2-2为各有机物组分分子式及名称。表2-2有机物中各组分分子式和名称分子式名称分子式名称C15H32十五烷C19H40十九烷C16H34十六烷C21H4403S丁基十七烷基酯C16H34O2-己基-1-癸醇C21H44二十一烷C16H22O4单2-乙基己基酯C24H50二十四烷C17H36十七烷C31H64三十一烷C17H32O14-甲基-8-十六碳烯C43H88四十三烷C18H38十八烷C44H90四十四烷由图2-5和表2-2可知，油基泥浆钻井岩屑中原油通过GC-MS分析出14种主要有机组分，以直链烷烃为主，有部分的醇类，酯类和烯烃类。保留时间在16~25min区间内，图谱中看出峰复杂，成分复杂，分离较差，主要为C15~C19直链烷烃和2-己基-1-癸醇，单2-乙基己基酯及14-甲基-8-十六碳烯有机物；保留时间在25~37min区间内，图谱中都是独立峰，分离较好，主要为C21和C24直链烷烃及丁基十七烷基酯有机物；保留时间在37~46min区间内，图谱中都是独立峰，分离较好，主要为C31，C43，C44高分子直链烷烃类有机物。这些组分均属于重油组分，在钻井全过程中可以很好的起到润滑钻头、稳定和加固井壁等作用。20 第2章油基泥浆钻井岩屑理化性质的分析在微生物降解过程中，正构烷烃优先被微生物降解利用，其次是异构烷类和不饱和烃类，而杂环芳烃类物质则较难被微生物降解利用，有些有机物质甚至会对微生物的生长代谢产生毒害作用，抑制其生长甚至杀死微生物。2.4本章小结（1）油基泥浆钻井岩屑的外观呈灰黑色，具有浓烈的气味；其理化性质为pH=7.02，呈中性；含水率为4.427%，含水率较低；化学需氧量（COD值）为187834mg/Kg；生化需氧量（BOD5值）为52990mg/Kg；含油量为67876mg/Kg，采用萃取法在转速180rpm/min的条件下，萃取剂量在固液比为1：2的最佳条件下，萃取6次，再用非分散红外法测定得到含油量。（2）油基泥浆钻井岩屑中的石油烃类有机质含量约占油基泥浆钻井岩屑总量的6.8%，超过《农用污泥中污染物控制标准》和《土壤环境质量标准》中石油烃类的标准值，最低13.6倍，说明油基泥浆钻井岩屑中石油烃类是主要污染物。（3）采用GC-MS进行成分分析，分析表明油基泥浆钻井岩屑中原油的成分主要是C15~C19，C21，C24，C31，C43，C44的直链烷烃及部分的醇类、酯类等有机组分。21 成都理工大学硕士学位论文第3章降解功能菌的选育钻井过程中，自然界的微生物进入油基泥浆岩屑中，在高浓度含油的极端环境中存活的微生物资源，在油基泥浆岩屑污染的环境修复方面有着潜在的应用价值。因此通过进行选择性富集，逐步驯化选择的过程来获得高效的，迅速降解烃类物质的功能微生物。本试验从油基泥浆岩屑中通过富集培养、涂布选择性培养、驯化及平板划线分离纯化，获得油基泥浆岩屑降解功能菌。3.1实验材料3.1.1实验样品（1）实验样品同2.2。（2）实验原油采油石油醚（30-60℃）从油基泥浆钻井岩屑中提取出来，离心后，待石油醚挥发完全后备用。3.1.2实验主要培养基富集培养基（LB培养基）：蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏3g，蒸馏水1000ml，pH调至7.0-7.2，如配固体培养基，需加入琼脂2%。高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min后，备用。无机盐培养基：NaCl1.0g，(NH4)2·SO40.617g，KH2PO40.50g，K2HPO41.0g，MgSO40.50g，CaCl20.1g，KCl0.10g，FeSO4·7H2O0.01g，蒸馏水1000ml，pH调至7.0-7.2，如配固体培养基，需加入琼脂2%。高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min后，备用。选择培养基：无机盐培养基+琼脂+原油（浓度为50mg/L）驯化培养基：无机盐培养基+原油（浓度依此为100mg/L，200mg/L，500mg/L，1000mg/L）复筛培养基：无机盐培养基+原油（浓度为1000mg/L）注：培养基中的“油”指从油基泥浆钻井岩屑中提取出来的原油3.1.3菌悬液的制备将降解功能菌株接种于LB培养基中富集培养，将处于对数生长期的菌液以5000rpm/min离心20min，用磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0）洗涤三次并稀释至适宜22 第3章降解功能菌的选育浓度。3.2试验方法3.2.1富集取10g土壤，加90ml蒸馏水，搅拌均匀，采用移液枪取10ml混合液加至装有100mlLB富集培养基的锥形瓶中，用硅胶塞封口，然后将锥形瓶放入恒温培养箱中，35℃，190rpm/min恒温培养24h后，取10ml浑浊富集液接入到新鲜的LB培养基中，在相同的条件下连续富集3代。3.2.2分离吸取上述富集液1ml做梯度稀释，稀释至适当倍数，取50ul涂布接种于选择培养基平板上，35℃恒温培养箱中培养3-5天。挑选单一菌落划线接种于选择培养基平板中培养，重复此操作2-3次，直到分离得到以原油为唯一碳源大的单一菌株为止。图3-1菌株的筛选步骤3.2.3驯化将分离获得的以原油为唯一碳源的单一菌株在驯化培养基上在35℃恒温培养箱中进行驯化培养，得到高效降解烃类物质的功能菌。23 成都理工大学硕士学位论文3.2.4复筛从上述驯化培养基中挑选生长较好、较大的单一菌株在LB固体培养基上进行四区划线，得到单菌落，将单菌落接种于LB液体培养基中扩大培养，取10%菌悬液加入到浓度为1000mg/L的原油为唯一碳源的无机盐培养基中，35℃，190rpm/min恒温培养7d后测其对原油的去除率。获得降解率较高的功能菌株。3.2.5纯化保种将通过复筛得到生长快、生长量大、降解率较高的菌株，在LB固体培养基上进行四区划线纯化，纯化2-3代后，接种于LB固体培养基斜面上，4℃低温保存备用。3.2.6降解率的测定以原油为唯一碳源的无机盐培养基接种培养7d后的含油量采用非分散红外测油法测定。将三角瓶内的培养液全部转移至250ml分液漏斗中，加入1+1硫酸进行酸化，调至pH为2，同时加入2g氯化钠。用10ml四氯化碳清洗锥形瓶后，移入分液漏斗中，重复此操作2次。充分震荡分液漏斗，静置分层后，将下部四氯化碳层采用装有无水硫酸钠的砂芯漏斗过滤，滤液直接接入100ml容量瓶中。水层继续用25ml四氯化碳重复萃取2-3次，操作同上。用5ml四氯化碳洗涤砂芯漏斗，重复1次，洗涤液全部收入至同一容量瓶中，然后四氯化碳定容至标线。取定容后萃取液50ul用四氯化碳稀释至25ml容量瓶中，稀释倍数为500倍。用四氯化碳作为参比较零，10mm石英比色皿，非分散红外测油仪测定含油量。以等量磷酸盐缓冲液（pH=7.0）代替菌悬液，进行空白试验，操作同上，测定其含油量。通过空白及降解后的测定数据进行去除率的计算，计算公式如下：m-m降解率（%）空白试验100%m空白（3-1）24 第3章降解功能菌的选育3.3功能菌的筛选结果3.3.1功能菌的初筛通过富集，选择性培养基的初筛分离得到菌落形态较好的以原油为唯一碳原的单一菌株，将获得的菌株采用驯化培养基驯化后获得功能菌株共15株，分别编号为T-1~T-15。为获得高效降解性能的功能菌需进行复筛实验。3.3.2功能菌的复筛功能菌株的对原油的处理效果：表3-1功能菌株对原油的处理效果菌株上部油层情况下部菌液情况摇匀后情况T-1絮状物，呈乳白色浑浊，褐色油絮状物能完全进入营养液中油颗粒几乎完全能进入营养液圆形小球状，呈褐色浑浊，黄褐色T-2中T-3絮状物，呈黄白色浑浊，棕色油絮状物能完全进入营养液中油颗粒几乎完全能进入营养液圆形细小球状，呈浅黄色浑浊，棕褐色T-4中T-5絮状物，呈浅黄色浑浊，灰色油絮状物能完全进入营养液中T-6颗粒状，呈乳黄色不透明，灰色大部分能进入营养液中T-7较大颗粒状，不规则，呈乳黄色不透明，灰色部分能进入营养液中T-8较大颗粒状，不规则，呈橙黄色不透明，褐色部分能进入营养液中T-9成油膜状，呈黄色半透明，白色一小部分能进入营养液中T-10成油膜状，呈黄色半透明，白色一小部分能进入营养液中T-11成油膜状，呈黄色半透明，白色一小部分能进入营养液中T-12成油膜状，呈黄色半透明，褐色一小部分能进入营养液中T-13成油膜状，呈黄色半透明，白色一小部分能进入营养液中T-14团聚呈完整的油膜，呈黄色透明，黄色完全不能进入营养液中T-15团聚呈完整的油膜，呈黄色透明，白色完全不能进入营养液中经过以原油为唯一碳原的选择培养基的初筛得到15株功能菌，将平板初筛的15株菌在35℃恒温摇床上进行振荡培养7d进行复筛，结果如表3-1，可以看出：T-1、T-2、T-3、T-4、T-5五株菌培养液明显变浑浊，T-6、T-7、T-8三株菌25 成都理工大学硕士学位论文培养液不透明，主要是由于细菌大量繁殖和部分油分子溶入水相中。其余菌株的培养液呈现出不透明和透明状，只有一小部分油分子溶入水相中或者几乎没有油分子溶入水相中，加入的原油呈现出形状不规则的颗粒状或者形成油膜状浮在培养液面上。通常情况下，仅仅靠表面直观的现象定性的评价菌株对原油的降解能力还不够严谨的，还需要对菌株的原油降解能力进行定量评价。3.3.3功能菌株的降解率表3-2功能菌株对原油的降解率菌株来源降解率T-1珙县油田油基泥浆钻井岩屑43.33T-2珙县炼油厂含油废水42.222T-3珙县油田油基泥浆钻井岩屑48.56T-4污水处理站含油废水43.611T-5珙县油田油基泥浆钻井岩屑48.1T-6珙县炼油厂含油废水32.56T-7珙县炼油厂含油废水22.67T-8污水处理站含油废水20.06T-9珙县炼油厂含油废水19.19T-10珙县油田油基泥浆钻井岩屑17.15T-11污水处理站含油废水15.12T-12污水处理站含油废水13.08T-13珙县油田油基泥浆钻井岩屑12.2T-14珙县炼油厂含油废水9.01T-15污水处理站含油废水7.85由表3-2看以看出：15株菌对原油的降解情况与菌株在以原油为唯一碳源的培养基中定性测定的生长情况基本上一致。各个菌株的对原油的降解能力各有不同，T-1~T-8八株菌株的降解效果较好，对原油的去除率在20.06%~48.56%之间，T-9~T-15七株菌株的降解效果较差，对原油的去除率在7.85%~19.19%之间。其中T-1~T-5五铢菌株的降解效果最好，去除率分别为43.33%、42.222%、48.56%、43.611%、48.1%，连续接种后能稳定生长，所以T-1~T-5五铢菌株是降解原油的优势功能菌种，可以选作本实验的研究菌种。26 第3章降解功能菌的选育3.3.4纯化保种将获得的T1~T-5五株优势功能菌株在LB固体培养基上进行四区划线进行纯化3~4次后保种于斜面培养基上，4℃保存。3.4本章小结经过不停的筛选、分离获得能够降解原油的菌株，通过对菌株的不断驯化，可以获得能降解不同石油烃组分的功能微生物，并建立菌种库，是高效处理油类环境污染的前提，是一项长期的、复杂的、庞大的工程。通过本章的研究，得出以下结论：1．筛选分离出能以原油为唯一碳源的油类降解菌的主要来源是被油类污染的岩屑、油田，炼油厂的含油废水和污水厂的含油废水等。2．以原油为唯一碳源的选择培养及增加一定碳原浓度的驯化培养，是目前分离出高效降解油类污染物功能菌的快捷并有效的一种方法。3．从珙县油基泥浆钻井岩屑、珙县炼油厂含油废水和污水处理厂含油废水中筛选得到15株对油份有一定降解率的功能微生物，通过连续接种后稳定生长及复筛的方法对菌株降解能力的评价，最终筛选出降解率超过40%的五株菌株T1、T2、T3、T4、T5，并作为本论文高效降解油类成分的功能菌株研究。27 成都理工大学硕士学位论文第4章功能菌的生理特性及鉴定本章对已获得的功能菌株进行生理特性分析，有利于对功能菌株的全面认识，掌握其新陈代谢规律，并在处理油基泥浆岩屑时更好地遵循这些规律，以达到更好地降解效果。并从微生物样品中提取DNA，对16SrRNA用特征引物进行PCR基因扩增、纯化等操作，获得目的基因的特异性片段后，测序并构建系统发育树进行微生物鉴定分析。4.1实验材料4.1.1实验样品（1）实验菌株为第三章筛选所得的高效功能菌株T-1~T-5。（2）实验所需原油为3.1.1（2）。4.1.2培养基实验所需培养基同3.1.24.2实验方法4.2.1功能菌的生理特性4.2.1.1菌落形态观察将分离纯化获得的功能菌株采用四区划线法接种于LB固体培养基上，倒置于恒温培养箱中35℃培养一定时间后，观察菌落的成长状态，比如菌落颜色、大小、形态等等；并将功能菌株接种于LB液体培养基中，35℃，190rpm/min恒温摇床培养一定时间后，观察菌液的培养状态，比如颜色、气味等。4.2.1.2菌株个体形态观察将功能菌株接种于LB液体培养基中，恒温摇床中35℃，190rpm/min培养一定时间后，在光学显微镜下观察个体形态。对优势菌株进行革兰氏染色，在光学显微镜下，用油镜观察染色，判断属于革兰氏哪些菌，为后期提取DNA提供依据。28 第4章功能菌的生理特性及鉴定4.2.1.3运动型及需氧类型观察采用穿刺法将优势菌接种于牛肉干蛋白胨固体培养基内，培养数天，观察生长情况，从而判断其运动性。采用四区划线法将优势菌接种于选择培养基平板上，在厌氧盒中进行厌氧培养数天，观察生长情况，从而判断其是否生长。4.2.1.4生长曲线测定细菌的生长量是采取光电比浊法测定培养液中的光密度（OD值）来间接确定的。将筛选得到的功能菌采用四区划线法接种于LB固体培养基上，在35℃恒温培养箱内活化3-4代，然后从平板上挑选生长好的单一菌落接种于新鲜LB液体培养基中，于35℃、190rpm/min摇床中培养24h后，4℃冰箱保存作为种子液。将种子液按2%的接种量接入到新鲜的的已灭菌的LB液体培养基中，35℃，190rpm/min培养。把754-紫外可见分光度计的波长调到600nm，开机预热20min。以等量菌悬液接种的LB液体培养基为空白，每隔一定时间取一次样，测定培养液的OD600。以OD600为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出优势菌株的生长曲线。4.2.2降解功能菌的分子学鉴定传统的微生物分类鉴定主要依据形态特征、显微镜观察以及生理生化特征等，随着基因工程、遗传学、生物化学和计算机科学的发展和技术渗透，逐步形成了分子生物学。分子生物学所学的分子性状是核酸数据或基因序列，利用核酸分子研究微生物分类鉴定具有广泛可比性、巨大信息量、准确可靠性、趋同性小和严密性等优点（李洁利，2002）。RNA是细菌核糖核苷酸，存在所有细菌的基因组中，16SrRNA是细菌核糖体30S小亚基的组成部分，是细菌繁殖在编码rRNA时相对应的DNA序列，以DNA分子为基础的分子生物学技术在微生物的研究领域逐步扩大及作用日益增大。（佘跃惠等，2005）16SrRNA基因序列包含约50个功能域，并具有高度的保守性和特异性等特点。4.2.2.1基因组DNA的提取微生物基因结构和功能研究的必要条件是提取NDA，提取的DNA片段长度一般不低于100-200bp。为了保证后续实验能顺利进行，在提取DNA的过程中，应尽可能的避免DNA断裂和降解，确保DNA的完整性。目前提取DNA主要方法为CTAB法，还有物理方法（冻融法、超声波法、研磨法、玻璃珠法、微波炉29 成都理工大学硕士学位论文法等）；化学方法（异硫氰酸胍法，碱裂解法）；生物方法（酶法）及依据不同的核酸分离纯化（阴离子交换树脂、硅质材料等）。并且应遵循保证DNA一级结构完整性；保证DNA样品中没有抑制作用的高浓度金属离子和有机溶剂；保证NDA样品中的杂质如蛋白质、多糖、脂类等生物大分子物质浓度在最低值；保证不是目标DNA等核酸如RNA应尽可能去除等原则。因此本实验在遵循DNA提取的原则下将功能菌株在液体培养基中培养到一定的浓度后，采用细菌基因组DNA提取试剂盒（购自天根生生化科技有限公司）提取细菌总基因组DNA。4.2.2.2PCR扩增PCR技术由于能将微量的DNA进行大幅度的复制扩增，比如无论是化石中的古生物、古人的骸骨还是一根头发、一滴血或者皮肤、甚至一个细胞中分离出一点核酸，就能进行PCR扩增，因而从发明就得到了广泛的应用，至今已发展到第三代。PCR技术具有灵敏度高、特异性强、简便快速、自动化和纯度要求低等优点。PCR反应的特异性取决于引物和模板DNA的正确的结合及引物链的延伸；遵循碱基互补原则；TaqDNA聚合酶的聚合反应忠实性；靶基因的特征性与保守性。本实验是以提取的细菌基因组为模板DNA经变性、退火、延伸的三个基本反应步骤进行PCR基因扩增：模板DNA在温度达到95℃左右一定时间的预变性后，模板DNA双链在94℃下变性并在解旋酶的作用下进行解旋，分离成为单链；单链模板DNA和引物在温度降至55℃左右一定时间，通过通用引物和单链DNA模板的互补序列配对相结合，形成单链DNA模板-引物结合物，该结合物在温度达到72℃左右一定时间内，在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按照碱基互补配对原则，合成一条与模板DNA双链完全一致的新DNA双链，新DNA双链在变性、退火、延伸三过程经过一定次数的循环，就能将目的基因放大几百万倍，即完成模板DNA的PCR扩增。最终PCR产物即可进行DNA测序等后续试验。DNA模板、引物、原料dNTP、聚合酶、解旋酶和镁离子是参与PCR反应的主要物质。本实验采用的通用引物如下：前引物27F:5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇后引物1492R:5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇本实验PCR反应体系为50ul，具体如表所示：30 第4章功能菌的生理特性及鉴定表4-1PCR反应体系试剂体积（ul）Template22×TaqPCRMasterMix2527F1.61492R1.6DdH2O加至50本实验PCR循环体系如下所示表4-2PCR循环体系温度（℃）时间循环次数程序955min1预变性9430sec29变性5530sec29退火721:40min29延伸725min1后延伸12∞-保温4.2.2.3凝胶电泳将得到的PCR产物进行凝胶电泳测试，试验方法如下：首先在制胶槽模中放置好预定规格的梳子，然后在三角烧瓶中以1×TAE电泳缓冲液配制1%的琼脂糖溶液25ml，放置于微波炉中加热，待琼脂糖完全溶解后，取出轻轻摇动使其混匀。待琼脂糖冷却至手感微烫时，加入5ulGoldView，混匀。将凝胶倒入制胶槽中，厚度约为5mm左右，制胶过程中注意避免气泡。待胶凝固后，取下梳子放入电泳槽中，将足量的TAE缓冲液加入向电泳槽中，保证液面没过凝胶，然后取10ulPCR扩增产物加入到胶孔中，以200bpDNALadder作参比，开启电泳仪，当电泳条带在131V移动20min后，关闭电源，去除凝胶于凝胶成像系统上观察电泳结果。4.2.2.4纯化回收在DNA提取的过程中仍然会存在不同程度的杂质污染，故在PCR扩增后应对DNA扩增产物进行DNA纯化。常用的纯化方法有氯化铯梯度离心法、有机溶剂提取法、聚乙二醇分级沉淀法、柱层析法和酶化消解法等（J.M.沃克等，2003）。本实验PCR产物电泳条带切割所需DNA的条带，采用琼脂糖凝胶DNA回收试31 成都理工大学硕士学位论文剂盒（购自天根生化科技有限公司）纯化回收后直接送往上海生工生物有限公司测序。4.2.2.5系统发育树的构建DNA测序技术，测定分析特征DNA片段碱基序列即腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）与胞嘧啶（C）排列方式的技术。测定分析DNA序列是分子生物学进一步研究和改造目基因的基础。测序原理主要有化学修饰法测序原理和Sanger法测序的原理，至今，我们通过Sanger测序法得到了绝大部分DNA序列。本实验对功能菌微生物16SrDNA序列进行测序后，将所得到的序列采用Chromas软件进行拼接，拼接所得序列再提交到GenBank数据库，通过运用Blast软件与已知的序列并进行相似性（identify）比对分析，并列出相似程度高的已知序列、相似度及其相对应的微生物种类，将分析结果采用ClustalW软件进行多序列比对。再通过构建系统发育树对微生物进行更为精准的分类。绘制系统发育树是生物信息学中描述不同生物之间的相关关系的方法也是在系统分类学中可视化表示进化关系最常用的的方法。应用MEGA5.0软件基于Neighbour-joinjing采用Bootstrapanalysis根据亲缘关性高的微生物大分子物质（16SrDNA、蛋白质、基因、酶等）的序列同源性，计算不同物种之间的进化距离，采用聚类分析的方法，将亲缘性高的微生物用树枝状的图形表示物种之间的亲缘关系。构建参数为：Neighbour-joinjing（Kimura2-parametermodel，BootstrapReplicationsof1000）。对于完整的一个进化树，进化树上需有进化节点、进化分支及进化距离。一个进化节点表示一个分类学单元（属、种群和个体等），进化分支表示不同分类单元之间的关系。完整进化树的分析需要进行目标多序列的排列，构建系统进化树，对系统进化树进行可信度评估三个步骤（吕宝忠等，2002）。通过实验所得的进化树与真实的进化关系存在一定的差别，只是对真实的进化关系进行评估和模拟。若模拟方法得当，得到的模拟进化树就可等同于真实的进化关系，通过某种数学方法对构建的模拟进化树可进行可信度评估，不同的目标其算法也不同。4.3.降解功能菌的生理特性结果4.3.1培养特征将筛选出的T-1~T-5五株功能菌进行四区划线后，在营养琼脂中培养24h的生长情况（图4-1，表4-3）。32 第4章功能菌的生理特性及鉴定abcde图4-1功能菌株在营养琼脂上的形态a为功能菌株T-1，b为功能菌株T-2，c为功能菌株T-3，d为功能菌株T-4，e为功能菌株T-5表4-3功能菌株在营养琼脂中的生长情况T-1T-2T-3T-4T-5菌落大小小，1-2mm大，3-5mm小，1-3mm中，2-3mm小，1mm形态圆形圆形椭圆形梭形圆形边缘整齐整齐不整齐不整齐整齐表面光滑、有光泽光滑、无光泽有圆心，光滑凸起、有褶皱光滑、有光泽高度0.5-0.8mm扁平扁平0.5-0.7mm0.3mm透明度不透明不透明不透明不透明不透明干湿情况湿润湿润干燥湿润湿润颜色乳白色黄白色黄白色白色乳白是否产色素不产不产不产不产不产功能菌在营养琼脂中的生长情况如图4-1所示，T-1菌落大小在1-2mm，高度在0.5-0.8mm，呈圆形，边缘整齐，表面湿润、光滑、有光泽，不透明，乳白色，不产色素；T-2菌落大小在3-5mm，呈圆形、扁平状，边缘整齐，表面湿润、光滑、无光泽，不透明，黄白色，不产色素；T-3菌落大小在1-3mm，呈椭圆形、扁平状，边缘不整齐，表面干燥、光滑、有圆形，不透明，黄白色，不产色素；33 成都理工大学硕士学位论文T-4菌落大小在2-3mm，高度在0.5-0.7mm，呈梭形，边缘不整齐，表面湿润、凸起、有褶皱，不透明，白色，不产色素；T-5菌落大小在1mm，高度在0.3mm，呈圆形，边缘整齐，表面湿润、光滑、有光泽，不透明，乳白色，不产色素。将筛选出的T-1~T-5五株功能菌进行液体牛肉膏蛋白胨培养24h的生长情况（表4-4）。表4-4功能菌株在LB液体培养中的生长情况T-1T-2T-3T-4T-5颜色黄白色褐色黄白色浅黄色浅黄色气味有臭味有臭味有臭味有臭味无味道培养基中层浑浊、均匀生长浑浊、均匀生长浑浊、均匀生长浑浊、均匀生长浑浊、均匀生长培养基下层少许沉淀少许絮状沉淀少许絮状沉淀少许絮状沉淀少许沉淀T-1培养基颜色为黄白色，有气味，中层浑浊、T-1均匀生长，下层有少许沉淀；T-2培养基颜色为褐色，有气味，中层浑浊、T-2均匀生长，下层有少许絮状沉淀；T-3培养基颜色为黄白色，有气味，中层浑浊、T-3均匀生长，下层有少许絮状沉淀；T-4培养基颜色为浅黄色，有气味，中层浑浊、T-4均匀生长，下层有少许絮状沉淀；T-5培养基颜色为浅黄色，无气味，中层浑浊、T-5均匀生长，下层有少许沉淀。4.3.2菌株的个体形态abcde图4-2功能菌株显微镜100倍的形态a为功能菌株T-1，b为功能菌株T-2，c为功能菌株T-3，d为功能菌株T-4，e为功能菌株T-534 第4章功能菌的生理特性及鉴定abcde图4-3功能菌株革兰氏染色100倍的形态a为功能菌株T-1，b为功能菌株T-2，c为功能菌株T-3，d为功能菌株T-4，e为功能菌株T-5表4-5功能菌株的个体形态、大小及染色情况T-1T-2T-3T-4T-5菌落形态球形长杆杆状长杆短杆革兰氏染色G-G+G+G-G-4.3.3细菌运动性及需氧型表4-6功能菌株的运动性及好、厌氧特性T-1T-2T-3T-4T-5运动性强弱中弱中好、厌氧特性兼氧兼氧兼氧兼氧兼氧对功能菌株的进行个体形态、革兰氏染色试验，由图4-2，图4-3，表4-4及表4-5可知，T-1为球形，强运动性，属于兼性厌氧、革兰氏阴性菌；T-2为长杆状，弱运动性，属于兼性厌氧、革兰氏阳性菌；T-3为杆状，运动性中等，属于兼性厌氧、革兰氏阳性菌；T-4为长杆状，弱运动性，属于兼性厌氧、革兰氏阴性菌；T-5为短杆状，运动性中等，属于兼性厌氧、革兰氏阴性菌。35 成都理工大学硕士学位论文4.3.4生长曲线1.61.41.21T-10.8T-2OD600T-3T-40.6T-50.40.200369121518212427303336时间/h图4-4功能菌株生长曲线微生物的生长经过停滞期、对数期、稳定期和衰亡期的一个过程。了解微生物的生长规律，对生产实践具有重大的指导意义。根据对数期的生长规律可以得到培养菌种时缩短工期的方法：接种对数期的菌种，采用最适菌龄，加大接种量，用于培养菌种相同组成的培养基；根据稳定期的生长规律，可知稳定期是产物的最佳收获期，也是最佳测定期，通过对稳定期到来原因的研究还促进了连续培养原理的提出和工艺技术的创建。由图4-4，T1基本没有停滞期，直接进入对数期，说明T-1对环境的适应能力强，在第9h结束对数期进入平稳期，平稳期较长。T-2的停滞期为1h，然后进入对数期，在18h时结束进入平稳期。T-3的停滞期为2h，进入对数期，在18h时结束对数期进入平稳期。T-4的停滞期为6h，进入对数期，在第27h结束对数期进入平稳期，其对数期曲线切线斜率相对其他4株较低，说明T-4的生长繁殖较慢。T-5的停滞期为1h，进入对数期在第18h结束对数期，进入平稳期。4.4降解功能菌的分子生物学鉴定结果4.4.1琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果将提取的五株菌株DNA模板使用设计引物做PCR扩增，得到特异性产物（以双蒸水替代菌的模板作为阴性对照没有条带）经2%琼脂糖，EB染色电泳后，36 第4章功能菌的生理特性及鉴定与200bpMaker相比，出现清晰的荧光条带（图4-5）：图4-5PCR扩增产物电泳图谱由图4-5，Marker（200bp）对应泳道M，其最顶端为2000bp。泳道0为基因空白对照，五株功能菌的16sRNA基因泳道对应Marker的泳道在1100bp左右处有清晰荧光带，没有其他杂带且空白的阴性对照处没有任何条带，说明五株菌PCR产物是经过PCR反应得到的特异性条带，而不是引物自身扩增的条带。将基因16sRNA进行PCR扩增后产物混合（三管合一）采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化回收后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，分析菌株种属。4.4.2系统发育分析结果将五株试验菌株测得的每个序列在“BasicLocalAlignmentSearchTool（BLAST）”中的“nucleotideblast”进行比对，找到与其相似的同源性最高的序列，利用ClustalX2.0进行比对分析后，再采用MAGE5.0软件绘制发育树（图4-6~图4-10）。图4-6菌株T-1系统发育树图谱37 成都理工大学硕士学位论文图4-7菌株T-2系统发育树图谱图4-8菌株T-3系统发育树图谱图4-9菌株T-4系统发育树图谱38 第4章功能菌的生理特性及鉴定图4-10菌株T-5系统发育树图谱由T-1~T-5系统发育树图谱可以看出：菌株T-1PCR产物测序得到1175bp序列，将该序列在NCBI上进行blast比对，系统发育树见图4-6，经分析菌株T-1为克雷伯菌属（Klebsiellasp.），同源性为97%；菌株T-2PCR产物测序得到1053bp序列，将该序列在NCBI上进行blast比对，系统发育树见图4-7，经分析菌株T-2为枯草芽孢杆菌属（Bacillussubtilisstrain.），同源性为98%；菌株T-3PCR产物测序得到1167bp序列，将该序列在NCBI上进行blast比对，系统发育树见图4-8，经分析菌株T-3为tequilensis芽孢杆菌菌株（Bacillustequilensisstrain.），同源性为97%；菌株T-4PCR产物测序得到1155bp序列，将该序列在NCBI上进行blast比对，系统发育树见图4-9，经分析菌株T-4为芽孢杆菌菌株（Bacillusstratosphericusstrain.），同源性为98%；菌株T-5PCR产物测序得到1131bp序列，将该序列在NCBI上进行blast比对，系统发育树见图4-10，经分析菌株T-5为不动杆菌属（Acinetobactersp.），同源性为99%。4.5本章小结（1）通过对筛选出的五株功能菌株进行培养特征、个体形态、运动性及需氧型的观察，T1为球形、革兰氏阴性、运动性强、兼性厌氧型菌株；T2为长杆状、革兰氏阳性、运动性弱、兼性厌氧型菌株；T3为杆状、革兰氏阳性、运动性较强、兼性厌氧型菌株；T4为长杆状、革兰氏阴性、运动性弱、兼性厌氧型菌株；T5为短杆状、革兰氏阴性、运动性较强、兼性厌氧型菌株。（2）经过对五株功能菌的生长曲线测定，确定菌株最佳接种时间。T1的对数期为0~9h；T2的对数期为1~15h；T3的对数期为2~18h；T4的对数期为6~27h；T5的对数期为1~15h。T4对数期曲线切线斜率相对其他4株较低，说明T4的生长繁殖较慢。（3）通过对功能菌的鉴定，菌株T-1PCR产物测序得到1175bp序列，为克39 成都理工大学硕士学位论文雷伯菌属（Klebsiellasp.）；菌株T-2PCR产物测序得到1053bp序列，为枯草芽孢杆菌属（Bacillussubtilisstrain.）；菌株T-3PCR产物测序得到1167bp序列，为芽孢杆菌菌株（Bacillustequilensisstrain.）；菌株T-4PCR产物测序得到1155bp序列，为stratosphericus芽孢杆菌菌株（Bacillusstratosphericusstrain.）；菌株T-5PCR产物测序得到1131bp序列，为不动杆菌属（Acinetobactersp.）。40 第5章功能菌对油基泥浆钻井岩屑的试验研究第5章功能菌对油基泥浆钻井岩屑的试验研究石油开采过程中会产生大量的油基钻井液、石油和岩屑组成的混合物，统称油基泥浆钻井岩屑，通过第二章的理化性质可知，废弃油基泥浆钻井岩屑中的石油烃类有机物较高的含量，约占废弃油基泥浆钻井岩屑总量的6.8%，最低超标《土壤环境质量标准》中二级工业用地标准13倍多。如其处理不当，将对环境造成严重的危害。目前国内外对废弃油基泥浆岩屑的主要处理技术大多数仍是物理、化学方法，但是处理技术都存在一定的局限性，并且易造成二次污染。微生物处理技术具有成本低、易操作、作用持久等优势，自然界中存在以烃为能源和碳源的微生物，这些微生物能降解各种不同类型的烃：短链烷烃、长链烷烃和许多芳香族化合物，由第二章的石油烃类有机质组分可知，油基泥浆钻井岩屑中油类成分主要是烷烃类，故能作为碳原营养物质被微生物利用。因此，本章采用第三章选育出来的降解功能菌T-1~T-5对油基泥浆钻井岩屑的降解处理实验，并通过对pH、温度、N-P比、盐浓度等环境影响因素探索功能菌降解的最佳条件，为后期的中试，乃至实际运用提供理论基础；通过反应前后石油烃类有机物的组分分析初步探索了本实验所得功能菌对其易降解的成分。5.1试验材料5.1.1样品来源试验选用的油基泥浆钻井岩屑取珙县油田，该样品外观呈深黑色，具有浓烈的挥发性有机物气味。5.1.2试验菌剂本实验所用菌株为实验室从珙县油田油基泥浆钻井岩屑、炼油中含油废水及污水处理厂的含油废水中筛选出对原油具有较好降解作用的功能菌菌株T-1、T-2、T-3、T-4、T-5。菌悬液的制备：同3.2.3。41 成都理工大学硕士学位论文5.2实验方法5.2.1环境影响因素功能菌种对烃类物质的降解能力不仅与自身的特性有关，同时还需要合适的环境条件才能更好的体现出其降解能力。环境条件的影响往往在功能微生物对有机污染物的处理上起着决定性的作用，比如温度、pH、环境中的营养成分、烃类浓度等等。这些影响主要是通过影响微生物与烃类物质接触的表面积发生变化和影响微生物降解酶的催化活性。5.2.1.1接种量的影响准备35个50ml锥形瓶，分别称取5g油基泥浆钻井岩屑，每组锥形瓶加入一定量的无机盐培养基，保持含水率在86%左右，pH调至7.0-7.2，设置7组功能菌菌悬液的不同接种量为1%，2%，5%，8%，10%，20%，30%分别接入T-1，T-2，T-3，T-4，T-5，以等量磷酸盐缓冲液（pH=7.0）代替菌悬液，作为对照。考查菌株在不同接种量下，对原油的降解能力。考察不同初始pH降解功能菌对原油的降解能力。将样品置于恒温摇床中以190rpm/min，35℃培养15d后，测定样品中的原油含量，计算降解率。每组实验设置3个平行样。5.2.1.2pH的影响准备25个50ml锥形瓶，分别称取5g油基泥浆钻井岩屑，每组锥形瓶加入一定量的无机盐培养基，保持含水率在86%左右，设置5组不同初始pH分别为3，5，7，9，11，各功能菌菌悬液按接种量10%分别接入T-1，T-2，T-3，T-4，T-5，以等量磷酸盐缓冲液（pH=7.0）代替菌悬液，考察不同初始pH降解功能菌对原油的降解能力。将样品置于恒温摇床中以190rpm/min，35℃培养15d后，测定样品中的原油含量，计算降解率。每组实验设置3个平行样。5.2.1.3温度的影响准备25个50ml锥形瓶，分别称取5g油基泥浆钻井岩屑，每组锥形瓶加入一定量的无机盐培养基，保持含水率在86%左右，pH调至7.0-7.2，设置5组不同温度分别为15℃，25℃，30℃，35℃，40℃，各功能菌菌悬液按接种量10%分别接入T-1，T-2，T-3，T-4，T-5，以等量磷酸盐缓冲液（pH=7.0）代替菌悬液，考察不同初始pH降解功能菌对原油的降解能力。将样品置于恒温摇床中以190rpm/min，35℃培养15d后，测定样品中的原油含量，计算降解率。每组实验设置3个平行样。42 第5章功能菌对油基泥浆钻井岩屑的试验研究5.2.1.4N-P比的影响准备30个50ml锥形瓶，分别称取5g油基泥浆钻井岩屑，每组锥形瓶加入一定量的无机盐培养基，保持含水率在86%左右，pH调至7.0-7.2，设置5组不同N元素含量分别为75mg/L、350mg/L、700mg/L、1400mg/L、2800mg/L、5600mg/L，其中PO3-4-P为177mg/L，各功能菌菌悬液按接种量10%分别接入T-1，T-2，T-3，T-4，T-5，以等量磷酸盐缓冲液（pH=7.0）代替菌悬液，考察不同初始pH降解功能菌对原油的降解能力。将样品置于恒温摇床中以190rpm/min，35℃培养15d后，测定样品中的原油含量，计算降解率。每组实验设置3个平行样。5.2.1.5盐浓度的影响准备35个50ml锥形瓶，分别称取5g油基泥浆钻井岩屑，每组锥形瓶加入一定量的无机盐培养基，保持含水率在86%左右，pH调至7.0-7.2，设置5组不同NaCl含量分别为0.1%、0.5%、1%、3%、6%、10%，各功能菌菌悬液按接种量10%分别接入T-1，T-2，T-3，T-4，T-5，以等量磷酸盐缓冲液（pH=7.0）代替菌悬液，考察不同初始pH降解功能菌对原油的降解能力。将样品置于恒温培养箱中以190rpm/min，35℃培养15d后，测定样品中的原油含量，计算降解率。每组实验设置3个平行样。5.2.3功能菌在最佳条件下的降解效果准备5个250ml锥形瓶，分别称取5g油基泥浆钻井岩屑，每组锥形瓶加入一定量的无机盐培养基，保持含水率在86%左右，各菌株在其最适pH，最适温度、最适N-P比及最适NaCl浓度下，按接种量10%分别接入优势菌T-1、T-2、T-3、T-4、T-5，在190rpm/min，35℃摇床中培养，每隔一定的时间测定其对油基泥浆钻井岩屑的去除率，在降解30d后加入一定要的菌悬液，隔15d后继续测定。5.2.3.1含油量的测定将降解后的样品1000rpm/min离心后105℃烘干后采用2.2.2方法测定。5.2.3.2化学需氧量（COD）的测定化学需氧量的测定方法同2.2.1.3。5.2.3.3生化需氧量（BOD5）的测定生化需氧量的测定方法同2.2.1.4。43 成都理工大学硕士学位论文5.2.4功能菌对石油烃类有机物的降解分析准备5个500ml锥形瓶，分别称取50g油基泥浆钻井岩屑，每组锥形瓶加入一定量的无机盐培养基，保持含水率在86%左右，各菌株在其最适pH，最适温度、最适N-P比及最适NaCl浓度下，按接种量10%分别接入功能菌T-3、T-5，在190rpm/min，35℃摇床中培养15d后，将油基泥浆钻井岩屑5000rpm/min离心10分钟，倒去上清液，油泥自然风干。将风干后的油泥置于250ml锥形瓶中，加入100ml石油醚（30-60℃）在摇床中20℃萃取2h，静止后取出上清液，密封好，置于4℃冰箱中，重复5次。将5次萃取液混合5000rpm离心5min，采用旋转蒸发仪回收石油醚并得到降解后的油品。将得到的石油类有机质混合物送至四川大学测试分析中心进行GC-MS组分分析。GC-MS分析实验条件：色谱条件:色谱柱为30m×0.32mm的OV-101石英毛细管柱，柱温40℃，停5min再以10℃/min升至150℃，停2min再以5℃/min升至290℃，汽化温度290℃，检测温度270℃，载气N2，柱前压0.4kg,检测器FID。质谱条件:离子源为电子轰击源(EI)、电子能量70eV、加速电压3kV、分辨率1000、真空度1.33×10-4Pa，进样系统温度190℃、电离室温度250℃、扫描范围m/z22—600。5.3结果与分析5.3.1环境影响因素5.3.1.1接种量的影响五株菌的降解率与接种量的变化趋势基本一致（图5-1）。当接种量小于10%时，随着接种量的增大，降解率逐渐增大，这是由于油量一定，菌的浓度增大，菌种的代谢也会随之增加，有利于菌种代谢油中的烃类物质；但是当接种量大于10%时，降解率基本保持稳定，因为营养液中碳、氮、磷源等营养物质的浓度是一定的，不能为大量微生物的持续繁殖提供足够的营养，不利于新生菌的繁殖与生长；另一方面菌密度的增加使得培养液粘度增加，使得溶解氧浓度降低，导致菌群活力下降。44 第5章功能菌对油基泥浆钻井岩屑的试验研究0.60.50.4/%0.3T-1T-2降解率T-3T-40.2T-50.101258102030投加量/%图5-1功能菌株接种量的影响5.4.1.2pH的影响不同微生物对pH值条件的要求各小相同，它们能在一定的pH值范_内生长，因此在一定程度上能够反映出微生物对环境的适应能力。由图5-2可以看出，五株功能菌在pH=7时，降解率都达到最大，pH低于或高于7，降解率有明显的下降趋势，T1，T2，T3三株菌受pH的变化趋势基本一致；T4，T5在pH=7~9时，降解率变化不大，以及pH=11的降解率高于pH=3时的降解率，可能是因为菌株对烃类化合物的降解有-COOH类化合物的中间产物生成，中和部分-OH，酶的活性未受到影响。5株菌在pH值较小的情况下有较低的降解率，是因为pH值过小使酶蛋白变性而失活，从而影响降解率。0.50.450.40.35/%0.30.25T-1T-2降解率0.2T-3T-40.15T-50.10.050357911pH图5-2pH的影响45 成都理工大学硕士学位论文5.3.1.3温度的影响温度是影响微生物生长、繁殖和新陈代谢的一个重要因素，改变温度必然会影响微生物体内所进行的多种生物化学反应，主要是影响酶的活性。因此，微生物生长繁殖必须有其适宜的温度范围，最适生长温度可能是由温度对生物体内无数个酶反应的综合作用决定的。由图5-3可以看出。五株菌在最适温度35℃时表现出最高的降解率，在42.2%~47.6%；降解率均受较低和较高温度的影响，因为低温能够使酶的活性受到抑制，细胞和新陈代谢活动减弱，酶活性的抑制作用随着温度的升高而被解除，细胞和新陈代谢活动加强，但是超过最适宜温度后，酶的活性降低，甚至失活，导致降解率降低。0.50.450.40.35%0.30.25T-1降解率0.2T-20.15T-3T-40.1T-50.0501525303540温度/℃图5-3温度的影响5.3.1.4N-P比的影响N、P营养元素的不足限制了微生物的生长繁殖，直接影响到降油功能菌的一个降解效果，但是过量的营养元素又会抑制微生物的生长繁殖。由图5-4可以看出。五株菌在P含量不变的情况下，N元素的不同添加量，表现出的降解率不同。N元素含量350~700mg/L时，降解率最大，且变化范围不大，在2~3%左右，700mg/L时降解率最高，最高为49.8%，按质量的计算N、P比在2:1~4:1之间。继续增大N元素的添加量提高N:P，降解率呈现下降的趋势，是因为营养物质过剩，抑制了降解功能菌的生长繁殖，进而导致降解率下降。这与黄廷林等（2006）的研究结果相似。46 第5章功能菌对油基泥浆钻井岩屑的试验研究0.60.50.4/%0.3降解率T-10.2T-2T-3T-40.1T-50175350700140028005600N元素含量/mg·L-1图5-4N-P比的影响5.3.1.5盐浓度的影响无机盐是细胞和酶的重要组成部分，是细菌某些酶的激活剂和辅助因子，并且适宜的盐浓度能维持生物体内恒定的渗透压。由图5-5可以看出，随着NaCl含量的增加，五株菌降解率均呈现先增加后降低的一个趋势，在NaCl含量为0.5%时，各菌生长最佳，其降解率都达到最高，在43.3%~53.4%，；随着盐浓度的增加各菌降解率呈现下降的趋势，在NaCl含量为10%时，菌种已基本无法存活，最高降解率才1.1%，主要因为Na+是功能菌生长繁殖的物质，含量较低会影响功能菌的生长繁殖，影响降解率，另外功能菌细胞膜是一种半透膜，膜内外侧的K+，Na+离子形成渗透压平衡体系，保证营养物质能正常进入细胞内，当膜外侧Na+浓度较高，形成膜外侧渗透压过大，破坏细胞膜内外的渗透压平衡体系，膜内侧的水分透过细胞膜进入膜外侧，以达到平衡，但当Na+浓度过高，膜内测的水分不足以使膜内外侧的渗透压达到平衡，造成细胞缺水死亡，进而影响降解率。图中T1在低盐浓度的降解率较高，在盐浓度10%时，降解率为0%，说明T1不具有耐盐性；T4在盐浓度逐渐增大，其降解率减少程度低于其它4株菌株，且T-4在盐浓度10%时，降解率为1.1%高于其它4株菌株，说明T4的耐盐性相对较好。47 成都理工大学硕士学位论文0.60.5T-10.4T-2/%T-30.3T-4T-5降解率0.20.100.10.513610盐浓度/%图5-5盐浓度的影响5.3.2功能菌在最佳条件下的降解效果0.550.50.45/%0.4T-1T-20.35降解率T-5T-40.3T-30.250.23915212733394551时间/d图5-6功能菌对钻井岩屑的降解率由图5-6可知：岩屑处理后，浓烈的挥发性有机物气味被削弱，其五株菌株在其最适环境条件下3d后的降解率达到30%-37%左右，说明对岩屑中有机成分有较好的降解效果；随着时间的推移，降解率逐渐增大然后趋于稳定。在18d时达到最大，50%左右。在30d时投加菌悬液，15d后降解率仍然处于平稳状态。据此猜测岩屑中部分可生化降解的成分分解了，部分难降解的仍然留在岩屑中。油基泥浆钻井岩屑在最佳环境条件下经T-1~T-5五株功能菌分别处理后，对其中的三项基础指标(含油率、COD、BOD5)进行测定，表5-1为测定结果。48 第5章功能菌对油基泥浆钻井岩屑的试验研究表5-1油基泥浆钻井岩屑处理后的基础指标T-1T-2T-3T-4T-5油含量（mg/Kg）35295.5236449.41235974.2835567.02434616.76COD（mg/Kg）97673.68100866.85899552.0298425.01695795.34BOD5（mg/Kg）27554.828455.6328084.727766.7627024.9将上表数据与与《土壤环境质量标准》（GB15618-2008）和《农用污泥中污染物控制标准》（GB4284-84）对比，得出含油量的超标倍数，如下：80687060《土壤环境质量标准》二级居住标准1000mg/Kg504035.336.435.935.534.6超标倍数3020100原样T-1T-2T-3T-4T-5样品图5-7岩屑处理后含油量的超标倍数图1613.61412《土壤环境质量标准》二级工业标准5000mg/Kg10877.27.197.116.9超标倍数6420原样T-1T-2T-3T-4T-5样品图5-8岩屑处理后含油量的超标倍数图49 成都理工大学硕士学位论文252220《农用污泥中污染物控制标准》3000mg/Kg1511.712.111.911.811.5超标倍数1050原样T-1T-2T-3T-4T-5样品图5-9岩屑处理后含油量的超标倍数图由表5-1，图5-7，5-8，5-9可知，油基泥浆钻井岩屑经五株功能菌处理后，岩屑中的含油量超过《土壤环境质量标准》中二级居住标准1000mg/Kg35倍左右，二级工业标准5000mg/Kg7倍左右，超过《农用污泥中污染物控制标准》中规定的标准值3000mg/Kg12倍左右，COD、BOD5仍远远超过《农用污泥中污染物控制标准》（GB4284-84）标准值，故经微生物处理后的油基泥浆钻井岩屑仍然属于较高浓度的污染物，通过微生物的降解实验可知，岩屑中可生化降解的有机质基本被降解完全，考虑可能对环境仍存在影响，可对功能菌处理后的油基泥浆钻井岩屑进行植物栽培实验，评价其对环境的危害。5.3.3功能菌对石油类烃有机物的降解分析图5-10油基泥浆钻井岩屑处理前有机成分GC-MS谱图50 第5章功能菌对油基泥浆钻井岩屑的试验研究图5-11油基泥浆钻井岩屑经T-3处理后有机成分GC-MS谱图图5-12油基泥浆钻井岩屑经T-5处理前有机成分GC-MS谱图表5-1油基泥浆钻井岩屑空白对照有机物中各组分分子式和名称分子式名称分子式名称C15H32十五烷C19H40十九烷C16H34十六烷C21H4403S丁基十七烷基酯C16H34O2-己基-1-癸醇C21H44二十一烷C16H22O4单2-乙基己基酯C24H50二十四烷C17H36十七烷C31H64三十一烷C17H32O14-甲基-8-十六碳烯C43H88四十三烷C18H38十八烷C44H90四十四烷51 成都理工大学硕士学位论文表5-2油基泥浆钻井岩屑经T-3处理前有机组分化学式及名称化学式名称化学式名称C11H2O1-萘酚,十氢-4a-甲基C19H40十九烷C13H23F3O2三氟乙酸丁酯C21H44二十一烷亚硫酸,丁基十七烷C14H281,2,4,5-四乙基环己烷C21H44O3S基酯C14H261-（1,1-二乙基）-萘C24H50二十四烷3-甲基-5-（1,4,4-三甲基-2-烯基）戊-1-C15H28OC31H64三十一烷醇C15H261,1,2-三甲基-3,5-二酮环己烷C43H88四十三烷C16H30O4丁基-6-ethyloct-3-基酯草酸C44H90四十四烷C17H36十七烷——表5-3油基泥浆钻井岩屑经T-5处理前有机组分化学式及名称化学式名称化学式名称C11H24O2-异丙基-5-甲基-1-庚C18H36十二烷基环己烷C11H20O1-萘酚,十氢-4a-甲基C18H382,6,10三甲基十五烷C14H24O甲基环戊檀香烯醇C19H402,6,10,14-四甲基十五烷C15H26十四氢-1-甲基菲C19H33F5O2五氟丙酸,4-十六烷基酯C15H261,4-甲醇萘-6,7-二乙基十氢C21H36二十一烷C16H34十六烷C23H46十七环己烷C16H32Cl21,16-二氯-十六烷C24H50二十四烷C16H30O4草酸,6-乙基辛-3-基异丁基酯C31H64三十一烷C17H36十七烷C43H88四十三烷C17H32O1,1-环己烷,4-（甲氧基）-4-丙基C44H90四十四烷油基泥浆钻井岩屑处理前有机成分GC-MS谱图分析（图5-10）及表5-1可知：油基泥浆钻井岩屑中油的组分在保留时间16.9~46.0min处均有峰出现，说明油基泥浆钻井岩屑废弃物中有机物成分复杂，共14种有机物组分。在保留时间16.9min~39min之间的有机物组分主要组分为C15~C19直链烷烃和2-己基-1-癸醇，单2-乙基己基酯及14-甲基-8-十六碳烯有机物和C21和C24直链烷烃及丁基十七烷基酯等11种有机物；在保留时间39min~46min之间的有机物组分主要为C31，C43，C44高分子直链烷烃类3种有机物。经T-3处理后的油基泥浆钻井岩屑有机成分GC-MS谱图（图5-11）及表5-2可知：T-3处理后的油基泥浆钻井岩屑中油的组分的保留时间在20~46min内均有峰出现，说明有机质组分复杂，共检测出15种有机质组分。在保留时间52 第5章功能菌对油基泥浆钻井岩屑的试验研究18~39min之间主要有机质组分为C11~C24的烷烃类、酸类、环烷烃类、酯类等12种有机物；在保留时间39min~46min之间的有机物组分主要为C31、C43及C44高分子直链烷烃类3种有机物。图谱5-11和表5-2相较于谱图5-10和表5-1可知，图谱5-11中出现峰时的保留时间向后推移了4min；在16.9~39min保留时间内出现的峰高及峰面积，图谱5-11均低于图谱5-10；在39~46min保留时间内出现的峰高及峰面积，图谱5-11与图谱5-10基本没有变化；而且表5-2相对于表5-1中增加了C11~C16的酸类、酯类、醇类及环己烷类等有机物，缺失了十五烷、十六烷和十八烷，对应图谱分析十七烷、十九烷、二十一烷、二十四烷减少了，说明功能菌T-3对C15~C19直链烷烃及C21和C24直链烷烃有较好的降解效果，产生酸类、酯类、醇类及环己烷类等中间产物。经T-5处理后的油基泥浆钻井岩屑有机成分GC-MS谱图（图5-12）及表5-3可知：T-5处理后的油基泥浆钻井岩屑中油的组分的保留时间在18~46min内均有峰出现，说明有机质组分复杂，共检测出20种有机质组分。在保留时间18~39min之间主要有机质组分为C11~C24的烷烃类，环烷烃类，酯类等17种有机物；在保留时间39min~46min之间的有机物组分主要为C31，C43，C44高分子直链烷烃类3种有机物。图谱5-12和表5-3相较于谱图5-10和表5-1可知，图谱5-12中出现峰时的保留时间向后推移了2min；在16.9~39min保留时间内出现的峰高及峰面积，图谱5-11均低于图谱5-10；在39~46min保留时间内出现的峰高及峰面积，图谱5-11与图谱5-10基本没有变化；而且表5-2相对于表5-1中增加了C11~C19的支链烷烃类、酯类、醇类及环己烷类等有机物，缺失了十五烷、十八烷和十九烷，对应图谱分析十六烷、十七烷、二十一烷、二十四烷减少了，说明功能菌T-5对C15~C19直链烷烃及C21和C24直链烷烃有较好的降解效果，产生支链烷烃类、酯类、醇类及环己烷类等中间产物。据上述分析，油基泥浆钻井岩屑中有机组分为C15~C24、C31、C43及C44的有机物，而且主要为直链烷烃类，其中C15~C24的有机物复杂多样；从油基泥浆钻井岩屑中筛选获得降解功能菌T-3和T-5对低于24个碳原子的直链烷烃类有较好的降解效果，这是因为微生物能够优先利用分子量较小的直链烷烃类有机物进行生理代谢活动，并且T-5的中间产物较于T-3复杂。5.4本章小结（1）通过对五株功能菌环境适应性的研究，确定功能菌在最佳接种量为10%，最佳pH=7，最佳温度为35℃，最佳N-P比在2:1~4:1之间，最佳盐浓度为0.5%的条件下，功能菌对油份的降解达到最大。T4，T5在pH=9时降解率有减小的趋势，但是变化不大，说明T4，T5适合中性偏碱性环境。53 成都理工大学硕士学位论文（2）五株菌株对油基泥浆钻井岩屑处理45d的实验中，随着时间的推移，降解率逐渐增大，在3d时降解率达到30%-37%左右，18d达到50%左右趋于稳定，30d时加入菌悬液后，降解率仍没有变化。说明对岩屑中有机成分有较好的降解效果，岩屑中部分成分可生化降解，部分成分难生化降解。（3）五株功能菌处理后的油基泥浆钻井岩屑中含油量相对《土壤环境质量标准》中二级居住标准1000mg/Kg超标35倍左右，三级工业标准5000mg/Kg超标7倍左右，超过《农用污泥中污染物控制标准》中规定的标准值3000mg/Kg超标12倍左右，仍然属于较高浓度的污染物，考虑可能对环境仍存在影响，可对功能菌处理后的油基泥浆钻井岩屑进行植物栽培实验，评价其对环境的危害。（4）通过对反应前后油基泥浆钻井岩屑中石油烃类有机物进行GC-MS组分分析，岩屑中有机成分主要为C15~C24个碳原子的小分子有机物和C31、C43及C44个碳原子的高分子有机物，其中C15-C24个碳原子左右的直链烷烃类有机物能被功能菌T-3，T-5降解成酸类、支链烷烃类、酯类、醇类及环己烷类等中间产物，C31、C43及C44个碳原子的高分子有机物不能被功能菌利用，T-5的中间产物较于T-3复杂。54 结论与展望结论与展望本论文主要针对油基泥浆钻井岩屑通过对理化性质的分析确定其污染程度，并对油基泥浆钻井岩屑中石油烃类有机物的组分分析，为后续实验提供了基础。从环境中筛选分离纯化得到高效降解功能菌株，并对功能菌株进行生理特性研究及采用分子生物学中16SrDNA测序的方法鉴定其种属；将获得的高效降解功能菌作用于油基泥浆钻井岩屑，考察其在不同接种量以及不同环境影响因素的降解效果并评价其安全性，通过对油基泥浆钻井岩屑生物修复反应前后的石油烃类有机物GC-MS的组分分析，初步探讨了功能菌对其易降解的组分。通过上述实验内容，得到了如下结论：（1）油基泥浆钻井岩屑的理化性质为：pH值为7.02，呈中性；含水率为4.427%，含水率较低；化学需氧量（COD值）为187834mg/Kg；生化需氧量（BOD5值）为52990mg/Kg；含油量为67876mg/Kg；外观呈黑灰色，具有浓烈的挥发性有机物气味，长时间放置外观未发生变化。珙县油基泥浆钻井岩屑中含油量是在最佳萃取条件为在转速180rpm/min的条件下，萃取剂量在固液比为1：2，萃取6次后通过非分散红外法测定得到的。（2）油基泥浆钻井岩屑中石油烃类有机质含量约占油基泥浆钻井岩屑总量的6.8%，相对于《土壤环境质量标准》（GB15618-2008）中规定的二级工业标准≤5000mg/Kg标准值，超标13.6倍；相对于《农用污泥中污染物控制标准》（GB4284-84）中规定的标准值≤3000mg/Kg，超标22倍。其COD、BOD5值更是远远的超过《农用污泥中污染物控制标准》（GB4284-84）标准中规定的标准值30mg/Kg、150mg/Kg，分别超过标准值的1252倍、1765倍。说明废弃油基泥浆钻井岩屑中的石油烃类有机物是主要的污染物质，可作为碳原被微生物利用的主要目标物质，必须经过无害化处理后才能排放至环境中或者作为其他用途。（3）油基泥浆钻井岩屑中主要是C15~C19，C21，C24，C31，C43，C44的直链烷烃及部分的醇类、酯类等有机污染物。。（4）从珙县油基泥浆钻井岩屑、珙县炼油厂含油废水和污水处理厂含油废水中筛选得到15株对油份有一定降解率的功能微生物，通过对菌株降解能力的评价，最终筛选出降解率超过40%的五株菌株T1、T2、T3、T4、T5。长期被油类污染的环境是获取油类污染物降解功能菌的重要来源。（5）对筛选出的五株功能菌株进行培养特征、个体形态、运动性及需氧型的观察：T1为球形、革兰氏阴性、运动性强、兼性厌氧型菌株；T2为长杆状、革兰氏阳性、运动性弱、兼性厌氧型菌株；T3为杆状、革兰氏阳性、运动性较强、兼性厌氧型菌株；T4为长杆状、革兰氏阴性、运动性弱、兼性厌氧型菌株；T5为短杆状、革兰氏阴性、运动性较强、兼性厌氧型菌株。55 成都理工大学硕士学位论文（6）经过对五株功能菌的生长曲线测定，确定菌株最佳接种时间。T1的对数期为0~9h；T2的对数期为1~15h；T3的对数期为2~18h；T4的对数期为6~27h；T5的对数期为1~18h。T4对数期曲线切线斜率相对其他4株较低，说明T4的生长繁殖较慢。（7）通过对功能菌的鉴定，菌株T-1测序得到1175bp序列，为克雷伯菌属（Klebsiellasp.）；菌株T-2测序得到1053bp序列，为枯草芽孢杆菌属（Bacillussubtilisstrain.）；菌株T-3测序得到1167bp序列，为芽孢杆菌菌株（Bacillustequilensisstrain.）；菌株T-4测序得到1155bp序列，为芽孢杆菌菌株（Bacillusstratosphericusstrain.）；菌株T-5测序得到1131bp序列，为不动杆菌属（Acinetobactersp.）。（8）研究五株功能菌在不同接种量及不同环境因素下的降解特性，五株功能菌在接种量为10%的降解达到最大，适应生长温度为35℃，在N-P比在2:1~4:1之间，盐浓度为0.5%的条件下，功能菌有较为明显的降解效果。T1、T2、T3在中性的环境适合生长，pH=7，T4、T5在pH=9时降解率有减小的趋势，但是变化不大，说明T4、T5适合中性偏碱性环境。（9）五株菌株对油基泥浆钻井岩屑处理45d的实验中，随着时间的推移，降解率逐渐增大，在3d时降解率达到30%-37%左右，18d达到50%左右趋于稳定，30d时加入菌悬液后，降解率仍没有变化。说明功能菌对岩屑中有机成分有较好的降解效果，部分成分可生化降解，部分成分难生化降解，难降解的有机物含量仍然超过《土壤质量环境标准》和《农用污泥中污染物控制标准》中规定的标准值，最低超过7倍左右。并对反应前后有机物进行GC-MS组分分析，通过对反应前后油基泥浆钻井岩屑中石油烃类有机物进行GC-MS组分分析，岩屑中有机成分主要为C15~C24个碳原子的小分子有机物和C31、C43及C44个碳原子的高分子有机物，其中C15-C24个碳原子左右的直链烷烃类有机物能被功能菌降解成酸类、支链烷烃类、酯类、醇类及环己烷类等中间产物，C31、C43及C44个碳原子的高分子有机物不能被功能菌利用。本文存在较多不足，在此提出对以后工作的几点展望：（1）油基泥浆钻井岩屑中的重金属含量可进行测定，评价对微生物的毒性；（2）选择较长质谱柱分析微生物对油基泥浆钻井岩屑中石油烃类化合物的降解分析；（3）研究生物反应器，进行放大降解试验，探讨放大试验的影响因素，进一步研究钻井施工现场的油基泥浆钻井岩屑污染场地的修复工艺和技术路线；（4）为考虑微生物处理后的油基泥浆钻井岩屑可能仍对环境存在影响，可将处理后的岩屑进行植物栽培试验，评价其对环境的安全性；56 结论与展望(5)功能菌株对珙县油基泥浆钻井岩屑处理后油含量较高，可考虑物化处理技术与微生物处理技术联合运用，提高对珙县有机泥浆钻井岩屑的处理。57 成都理工大学硕士学位论文致谢本论文是在导师刘国教授的悉心指导下完成的。刘老师博学多识，严谨的治学风格、严谨的科学态度、精益求精的的工作风格、诲人不倦的优良品质，在这研究生的三年中我收益匪浅，并是我日后社会工作中学习的标杆。同时，刘老师在对我们学生的生活上、为人处事上给予我们细心的关怀、最大的帮助和谆谆教诲是我一生的财富并时时的启发着我。在这毕业将至之际，谨向刘老师致以崇高的敬意和真诚的谢意。本论文所有实验是在成都生物所完成的。感谢生物所这个科研平台，感谢实验指导老师谢翼飞副研究员，给予我的关怀与帮助。论文的选题、实验方案的设计和实施、论文的框架和撰写等各个环节均凝聚着谢老师的心血和汗水。感谢谢老师在课题研究中困难时的帮助，迷惑时的提点，失落时的鼓励和开心时的分享，更感谢谢老师在思想和生活上的关怀和帮助。感谢我的同窗好友张云龙、粟丰、王琳、何娟、吴茜。我们相识相知何其有幸，一起学习一起娱乐的日子，是我终生难忘的回忆。感谢我们的互相帮助，互相学习。学业上一起刻苦努力，生活中相互陪伴，困难时施以援手，失落时倾听鼓励。点点滴滴，铭记于心。感谢师兄师姐张俊杰、吕龙、李军、韩国睿、杨衔、裴昭君、郑文婕、刘国、周雅琪、刘国明、徐磊以及何佼，感谢师弟徐熊鲲、陈西亮、高阳阳、陈政阳以及其他未署名的师弟师妹，我们就像一个大家庭一样。感谢在我三年研究生求学过程中你们的帮助与支持，感谢这个优秀的团队。论文实验能够顺利的完成，离不开实验室的兄弟姐妹们的大力支持与帮助，感谢岳华、梁雅洁、周婧超、杨娟等师兄师姐，徐熊鲲、陈政阳、姚梦涛、徐粘琴、李婷婷、任常琦、赵玉萍、陈瑜江、杨超、袁晓琴、陈昶、王汉文等师弟师妹在试验过程中与我并肩作战，熬过寒暑，经历实验过程的艰辛，分享实验成果的喜悦以及在生活中给予我的关心和帮助。深深地感谢我的家人，他们无微不至的关怀和无私的爱是我得以顺利完成学业的坚强后盾，同时也是我为之拼搏奋斗的动力和源泉！最后，对参加本论文答辩和对本论文提出宝贵意见的所有专家对参加本论文答辩和对本论文提出宝贵意见的所有专家、老师和同学表示诚挚的谢意，对论文参考文献的所有作者表示感谢！同时，向所有关心我、帮我的老师、朋友、同学、师弟师妹和亲人们表达我最真挚的谢意和最美好的祝福！58 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