中药补肾方剂对大鼠骨肉瘤细胞增殖及相关酶活性的影响

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1、中药补肾方剂对大鼠骨肉瘤细胞增殖及相关酶活性的影响【关键词】中药　　EffectofChinesemedicineBushenrecipeonproliferationandproteinkinaseactivityinratosteoblastlikecellsinvitro　　【Abstract】AIM:TostudytheeffectofChinesemedicineBushenrecipe(BSR)onproliferationandproteinkinaseactivityofcellulars

2、ignalingtransductionsysteminratosteoblastlikecells(UMR106).METHODS:UMR106cellseasuredbyMTTassay.Theproteinkinasesamplesolof32PATPincorporation.RESULTS:Byconcentrationof1×10-1-1×10-5g/LofBushenrecipe,thecellproliferationoted.By1×10-4g/L,theTPKandPKCactivit

3、yincreasedby44.8%and95.1%respectivelyinUMR106cells.CONCLUSION:BSRdosecouldactivateandimprovescellularsignalingtransductioninUMR106cells.Theproliferationofthecellsmaybeduetothisprocess.　　【Keya公司；其余试剂为国产分析纯产品.中药补肾方剂由淫羊霍、杜仲、熟地黄、地骨皮、淮牛膝、山茱萸各10g组成，经生药教研室鉴定.用三蒸

4、水浸泡、煎煮2次，再经750mL/L乙醇沉淀，回收乙醇，制成相当于生药2kg/L的药液，调pH至7.0，过滤除菌，分装，密封放置冰箱备用.大鼠成骨肉瘤细胞株UMR106由北京医科大学生物化学与分子生物学系转赠，源于美国哈佛医学院麻省总医院内分泌研究室，细胞培养于含100mL/L小牛血清的MEM培养液中.　　1．2方法　　1.2.1MTT法检测细胞增殖UMR106细胞于50mL/LCO2，37℃恒温培养.长满后用胰酶和EDTA消化，铺入96孔细胞培养板中（1×108/L），0.2mL/孔，继续培养24h，然

5、后加入不同浓度的含药无血清MEM培养液(每个浓度4个复孔)，对照组只加培养液.实验组按照不同加药浓度分为5组（表1）.继续培养48h，弃去含药细胞培养液，加入1g/L的MTT溶液50μL培养3h后，吸去上清液，加入150μLDMSO,待沉淀完全溶解后以595nm为测定波长，655nm为参比波长，测定吸光度值，按照x±2s作质量控制，凡是超出控制标准的均进行了复查.以含有等体积的DMSO未加中药的细胞孔测得的吸光度值为空白对照.　　1.2.2蛋白激酶活性测定细胞在含100mL/L小牛血清的MEM培养液中培养

6、.长满后继续以无血清培养液继续培养48h，然后换中药补肾方剂(1×10-4g/L)无血清ＭＥＭ培养液继续培养48ｈ,每24ｈ换液1次，对照组所用培养液不含补肾方剂.待细胞用药物处理完毕后，用冷PBS洗细胞2次,迅速将细胞收集于15mL离心管中，4℃,3000r/min离心5min，弃去上清液，用Tris・HCl缓冲液25mmol/L［pH7.5］，蔗糖0.25mol/L，EDTA和PMSF1mmol/L，MgCl2和KCl5mmol/L，TritonX1005mL/L，亮胰蛋白酶肽和胃蛋白酶

7、抑制剂少许悬浮细胞,液氮反复冻融3次,4℃,11200g/min离心10min，取上清液,测定TPK和PKC活性.酪氨酸蛋白激酶（tyrosineproteinkinase,TPK）反应体系的终浓度为：50mmol/LTris・HCl［pH7.5］，50μmol/LNa3VO4，7g/LPNPP,50mmol/LMgCl2,5mmol/LMnCl2,8.5g/LpolyGlu∶Tyr［4∶1］.蛋白激酶C（proteinkinaseC,PKC）反应体系的终浓度为：20mmol/LTris&#

8、12539;HCl［pH7.5］，1mmol/LCaCl2，1μgDG，10μgPS，1g/LPolyArg∶Ser［3∶1］.两体系分别加入5.55kBqγ32PATP，并以蛋白含量计算，加入适量含酶细胞匀浆上清液，以启动反应，反应总体系50μL，30℃准确保温，10min后立即终止反应.将反应液40μL点至R106细胞增殖中药补肾方剂提取液对UMR106细胞增殖有促进作用，其中药物浓度在1×10-1和1×10-2g/L时细